豬囊尾蚴pVAX1-AgB重組質(zhì)粒的免疫效果研究.pdf

1、豬囊尾蚴病是由豬帶絳蟲（Taenia Solium）幼蟲寄生于人或豬等中間宿主引起的人畜共患寄生蟲病。雖然傳統(tǒng)的驅(qū)蟲藥物在囊蟲病的治療方面仍發(fā)揮著重要的作用，但是長期、多次用藥因藥物殘留所致的食品安全問題直接影響著人體健康。這使得我們不得不改變思路，采用經(jīng)濟(jì)、安全、高效的疫苗防治該病的流行。豬囊尾蚴B抗原又叫副肌球蛋白，是由囊尾蚴體壁細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到蟲體外的一種蛋白質(zhì)，該抗原可通過抑制補(bǔ)體激活途徑，在囊尾蚴與宿主的免疫作用中對(duì)蟲體起保護(hù)

2、性作用，是WHO提出的血吸蟲疫苗候選抗原之一，是一種最有希望的蠕蟲疫苗候選抗原。
　　 本研究根據(jù)GenBank中登錄的AgB基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR技術(shù)從豬囊尾蚴總RNA擴(kuò)增出AgB基因，連接到pGEM-T Easy載體并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，獲得的AgB基因完整的開放閱讀框（ORF）大小為2590bp，與GenBank中登陸的基因同源性達(dá)99.7%。同時(shí)，設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，以重組質(zhì)粒pGEM-AgB為模板進(jìn)行PC

3、R擴(kuò)增，經(jīng)EcoR I、Not I雙酶切，回收目的片段并與pGEX-4T-1載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-AgB，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)及純化，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果在121ku處出現(xiàn)了清晰的目的蛋白條帶，與預(yù)期的分子量大小相一致，經(jīng)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)產(chǎn)物能被豬囊尾蚴陽性血清所識(shí)別，說明表達(dá)的外源蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。
　　 設(shè)計(jì)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體引物，以重組質(zhì)粒pGEM-AgB為模板

4、，經(jīng)PCR擴(kuò)增，BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后連接哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX1-AgB。大量提取重組質(zhì)粒，以100μg/只的劑量肌肉注射免疫5周齡健康BALB/c小鼠，同時(shí)設(shè)PBS和pVAX1質(zhì)粒對(duì)照組，在免疫后不同時(shí)間采血進(jìn)行ELISA抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示小鼠免疫后2w即可檢測(cè)到抗體，免疫后6 w達(dá)到高峰，且維持在一個(gè)較高水平，之后逐漸下降，38w后基本消失，抗體持續(xù)時(shí)間達(dá)8個(gè)月之久，而 PBS組和pVAX1對(duì)照

5、組則沒有檢測(cè)到抗體。
　　 為了進(jìn)一步研究pVAX1-AgB重組質(zhì)粒的免疫效果，本實(shí)驗(yàn)以pVAX1-AgB重組質(zhì)粒1000μg/頭的劑量經(jīng)肌肉免疫健康家豬，同時(shí)以AgB原核表達(dá)重組蛋白組（200μg/頭）、pVAX1組（1000μg/頭）和PBS組作為不同的對(duì)照組對(duì)該核酸疫苗進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，用ELISA測(cè)定各組的抗體水平，同時(shí)檢測(cè)血清中IL-4和IFN-γ的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，pVAX1-AgB重組質(zhì)粒組免疫后第4w即檢測(cè)到抗體，

6、第8w達(dá)到峰值；AgB重組蛋白組免疫后的2w即可檢測(cè)到抗體，第6w達(dá)到峰值；pVAX1-AgB質(zhì)粒組抗體水平明顯低于AgB重組蛋白組。實(shí)驗(yàn)豬一免后pVAX1-AgB質(zhì)粒組和AgB重組蛋白組IL-4、IFN-γ表達(dá)水平均升高，二免后又高于一免，兩次免疫后IL-4、IFN-γ水平明顯都高于免疫前（P<0.01）；pVAX1-AgB質(zhì)粒組和AgB重組蛋白組的IL-4、IFN-γ表達(dá)水平無明顯差異，說明pVAX1-AgB重組質(zhì)粒和AgB重組蛋白