豬囊尾蚴dUTPase的表達、活性分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測.pdf

1、豬囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是由豬帶絳蟲(Taenia solium)的幼蟲豬囊尾蚴(Cysticercus cellulose)所引起的一種人畜共患病.該病廣泛存在于發(fā)展中國家,不僅嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟損失,而且還威脅著人類身體健康.因此,1993年世界衛(wèi)生組織將豬囊尾蚴病列為需要根除的六大疾病之一.目前,囊蟲病的防治以疫苗免疫和藥物治療為主,但普遍存在疫苗保護力不夠、藥物的毒副作用太

2、大等缺點,所以新型疫苗和藥物的研制一直是人們關(guān)注的焦點.dUTP焦磷酸酶(dUTPase)是一種重要的DNA復(fù)制修飾酶,廣泛存在于各種生物有機體中,可特異性水解dUTP產(chǎn)生dUMP和PPi,防止DNA復(fù)制過程中dUTP濃度過高而引起的錯誤摻入,提高了DNA復(fù)制的精確性.近年來dUTPase作為一種新的藥物靶蛋白越來越受到人們的重視,許多病毒、細菌和寄生蟲的dUTPase晶體結(jié)構(gòu)被解析,研究dUTPase在抗囊尾蚴病中的作用,為dUTPa

3、se的藥物設(shè)計和開發(fā)提供了有力的支持. 本實驗首次成功克隆出豬囊尾蚴dUTPase(Cysticercus cellulose dUTPase,CY dUTPase)基因,測序結(jié)果顯示與已知的豬帶絳蟲六鉤蚴dUTPase基因的核苷酸同源性為100﹪.為進一步研究CYdUTPase的生物學(xué)功能,將其與pET28載體連接后在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了大量表達,表達產(chǎn)物主要以可溶性形式存在.同時將pET28空載體進行相同的表達

4、純化對照實驗,重組表達菌液的超聲上清經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠純化后進行SDS-PAGE檢測,結(jié)果只是在重組豬囊尾蚴dUTPase菌液上清中出現(xiàn)21KD大小的特異性條帶,這說明本實驗表達純化的CY dUTPase中完全排除了宿主dUTPase的污染.dUTPase催化底物(dUTP)生成dUMP和焦磷酸(PPi),PPi與鉬酸銨形成的復(fù)合物在575nm有特定的光吸收值,測定575nm的OD值就能計算出PPi的量.在CY dUTPase的催化反應(yīng)中,

5、通過測定產(chǎn)物PPi單位時間的生成量來計算底物的消耗量,以此計算酶的催化活力.結(jié)果顯示重組dUTPase每分鐘水解lnmol dUTP所需的酶量為21.3095μg,純化的dUTPase 1個酶活力單位為21.3095μg;酶的比活力為46.929U/mg.在酶促反應(yīng)體系中加入不同金屬離子或EDTA后測定dUTPase活力的變化,結(jié)果EDTA可以抑制CY dUTPase的活性;而金屬離子可以增強酶的活性.同時金屬離子還可以恢復(fù)被EDTA抑

6、制的dUTPase的活性,其中以Zn<'2+>的恢復(fù)效果最明顯,可以使dUTPase的活性恢復(fù)99.65﹪.在所測定的四種金屬離子中,Mg<'2+>對dUTPase活性的增強作用最明顯. 為進一步研究CY dUTPase結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系,用SWISS-MODEL直接構(gòu)建了CY dUTPase的3D模型,通過WHAT IF、ProSac程序?qū)δＰ瓦M行立體化學(xué)結(jié)構(gòu)、能量分布的質(zhì)量評估,模型評估的得分結(jié)果表明所建模型結(jié)構(gòu)合理.CAST

7、p程序的口袋分析顯示CY dUTPase共有27個活性口袋,其中第26號口袋主要由CY dUTPase的β-發(fā)夾構(gòu)成,該發(fā)夾結(jié)構(gòu)是大多數(shù)已知晶體結(jié)構(gòu)的三聚體dUTPase活性口袋的重要組成部分,表明CY dUTPase可能與其它三聚體dUTPase具有同樣的催化機制.CY dUTPase C端的Gly富集區(qū)(Gly-X-Gly-X-X-GIy),Ala(83)和Tyr(90)等這些關(guān)鍵氨基酸與其它三聚體dUTPase(Human dUT

8、Pase)高度保守,這些氨基酸不僅能維持口袋區(qū)正常的空間結(jié)構(gòu),同時也在酶與底物的識別中起決定性作用.通過對不同類型dUTPase晶體結(jié)構(gòu)的分析,推測CY dUTPase屬于同源三聚體.用SymmDock程序預(yù)測了CY dUTPase的四級結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)顯示CY dUTPase的活性區(qū)是由3個亞基各自的p.發(fā)夾、α-螺旋和C端環(huán)肽鏈共同組成,這與大多數(shù)三聚體dUTPase的催化活性區(qū)結(jié)構(gòu)相一致.將CY dUTPase的四級結(jié)構(gòu)與已知三聚體d

9、UTPase的晶體結(jié)構(gòu)進行疊合,結(jié)果顯示兩者能很好的吻合,證明構(gòu)建的CY dUTPase四級結(jié)構(gòu)合理.成功構(gòu)建的CY dUTPase 3D模型為抗囊蟲藥物的設(shè)計和開發(fā)提供了一個良好的研究模型. 通過在線服務(wù)器設(shè)計CY dUTPase的siRNA靶位點,針對靶序列設(shè)計shDNA(short hairpinDNA)時,在其3'端引入一段與鼠u6啟動子3'端同源互補序列,5'端則加入一段下游通用引物,設(shè)計好的shDNA由IDT公司合成

10、.從鼠的肌肉中提取基因組并擴增出U6啟動子序列,將U6啟動子和shDNA一起退火延伸,分別用U6啟動子的上游引物和shDNA的下游引物進行PCR,采用重疊延伸一步法制備CY dUTPase的siRNA表達盒(siRNA expression cassettes,SECs).選取豬囊尾蚴肌動蛋白基因(clone pAT5 actin)作為內(nèi)參照,建立了CY dUTPase基因半定量RT-PCR的檢測方法.CY dUTPaSe干涉表盒的制備