抗豬囊尾蚴單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增和序列分析.pdf

1、豬囊尾蚴病是由豬帶絳蟲的幼蟲(囊尾蚴)引起的一種人畜共患病。我國(guó)人體囊尾蚴病分布廣泛，嚴(yán)重威脅著廣大人民健康。多年來(lái)防治本病主要是以藥物防治為主，但是由于抗藥性的不斷出現(xiàn)及藥物殘留等問(wèn)題的嚴(yán)重性，限制了其在臨床上的應(yīng)用。進(jìn)入20世紀(jì)80年代后，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了抗體研究的進(jìn)展，基因工程抗體應(yīng)運(yùn)而生。其中單鏈抗體是目前應(yīng)用最為廣泛的重組抗體，在各個(gè)領(lǐng)域均有大量研究報(bào)道。但在寄生蟲研究中尤其是豬囊尾蚴領(lǐng)域沒(méi)有單鏈抗體的報(bào)道。本實(shí)

2、驗(yàn)克隆出抗豬囊尾蚴單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)基因片段，為抗豬囊尾蚴單鏈抗體的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。 方法：首先，復(fù)蘇分泌抗豬囊尾蚴單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)分泌抗豬囊尾蚴單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的活性。取活性高的雜交瘤細(xì)胞，用Trizol一步法提取分泌抗豬囊尾蚴單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞總RNA。然后，根據(jù)genebank公布的相關(guān)序列，合成兩對(duì)特異性引物，以提取的總RNA為模板，經(jīng)一步法RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增抗體輕

3、重鏈可變區(qū)基因。最后，將擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因與克隆載體pMD18-T連接，瓊脂糖電泳檢測(cè)后，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞JM109。藍(lán)白斑法篩選出陽(yáng)性重組子進(jìn)行菌落PCR鑒定。取含有陽(yáng)性重組子的菌液送至生物公司測(cè)序。 結(jié)果：提取分泌抗豬囊尾蚴單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞總RNA后，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取得總RNA。結(jié)果顯示：A260/280值=1.96； RNA瓊脂糖凝膠電泳可以清晰地看到28sRNA，18sRNA的條帶。

4、證明得到了能夠分泌抗豬囊尾蚴特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞總RNA。以提取的總RNA為模板，一步法RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增抗體輕重鏈可變區(qū)基因。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因長(zhǎng)度在400bp左右，符合鼠抗體特征，表明得到了抗豬囊尾蚴單克隆抗體輕重鏈可變區(qū)基因片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收后連接克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，藍(lán)白斑法篩選出陽(yáng)性重組子，以通用引物對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行鑒定，菌落-PCR檢測(cè)證明重組