氯嘧磺隆單克隆抗體的制備及其單鏈抗體基因的克隆.pdf

1、本文報(bào)道了除草劑氯嘧磺隆(chlorimuron-ethyl，俗稱豆磺隆)單克隆抗體的制備、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和膠體金免疫層析試紙條快速檢測(cè)法的建立以及抗氯嘧磺隆單鏈抗體基因的克隆。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 試驗(yàn)采用2-(氨基磺?；?苯甲酸乙酯通過琥珀酸酐法合成了半抗原，用活性酯法將活化的半抗原與載體蛋白BSA和OVA交聯(lián)，制備了氯嘧磺隆人工抗原。定量分析結(jié)果表明，半抗原與BSA的交聯(lián)比為16：1，與OVA的交聯(lián)比為12：1。用人工

2、抗原(半抗原-BSA)免疫Balb/c小鼠，iC-ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明，5只小鼠抗血清效價(jià)可達(dá)0.4-1.6×104，證明抗血清中有氯嘧磺隆特異性抗體產(chǎn)生。 成功篩選出抗氯嘧磺隆單克隆抗體，并建立了優(yōu)化的ELISA檢測(cè)方法。小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，用克隆技術(shù)共篩選到8株分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用擴(kuò)增培養(yǎng)后的1F5C5A10雜交瘤細(xì)胞株誘導(dǎo)小鼠腹水，單克隆抗體經(jīng)硫酸銨和親和層析純化，其效價(jià)為6.4×104，親

3、和常數(shù)為3.27×109L/mol，屬于IgG1亞類，輕鏈為κ型；單克隆抗體的特異性較強(qiáng)，與氯嘧磺隆結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率分別只有0.1％-2.2％。iC-ELISA試驗(yàn)表明，常規(guī)iC-ELISA和簡化后的iC-ELISA的IC50值分別為11.6ng/mL，28.7ng/mL，最適測(cè)定范圍分別為1.6-84ng/mL和2.2-372ng/mL，從結(jié)果可以看出，兩種用單抗所建立的ELISA法同前人所報(bào)道的用化學(xué)特異性的多抗所建立的ELI

4、SA法(54ng/mL)相比，其IC50值均顯著地降低。添加試驗(yàn)中，水樣中的氯嘧磺隆檢測(cè)范圍為1-500ng/mL，常規(guī)iC-ELISA的平均回收率為90％，數(shù)值在74％-114％之間；簡化iC-ELISA法的平均回收率也為90％，但變幅范圍較窄，為84％-102％。土壤中的氯嘧磺隆濃度范圍0.02-1.25μg/g，常規(guī)iC-ELISA平均回收率為256％，數(shù)值在216％-326％之間；簡化的iC-ELISA平均回收率112％，數(shù)值變

5、幅從99％到129％。顯然，簡化的iC-ELISA的檢測(cè)結(jié)果好于常規(guī)iC-ELISA。 建立了氯嘧磺隆的膠體金免疫層析試紙條快速檢測(cè)法。利用膠體金標(biāo)記的氯嘧磺隆單克隆抗體，半抗原-牛血清白蛋白和羊抗鼠IgG，制備了氯嘧磺隆膠體金免疫檢測(cè)試紙條，該試紙條的最低檢測(cè)極限為100ng/mL，檢測(cè)時(shí)間10min。8個(gè)土壤樣品分別添加0-2000ng/g的氯嘧磺隆標(biāo)樣，提取2h后用氣相色譜和試紙條進(jìn)行檢測(cè)，如果以100ng/g作為陽性與陰

6、性樣品的區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，試紙條檢測(cè)結(jié)果和氣相色譜所測(cè)的結(jié)果完全一致。所制備的膠體金免疫檢測(cè)試紙條可以用于土壤中氯嘧磺隆殘留的檢測(cè)。 克隆了抗氯嘧磺隆單鏈抗體基因片段。以雜交瘤細(xì)胞總RNA為模板，Oligo(dT)作引物，采用RT-PCR技術(shù)，合成了cDNA第一鏈。根據(jù)小鼠單克隆抗體可變區(qū)存在相對(duì)保守序列的特性，設(shè)計(jì)了相應(yīng)引物，擴(kuò)增了單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。DNA序列測(cè)定和國際互聯(lián)網(wǎng)檢索結(jié)果表明：得到的抗氯嘧磺隆單克隆抗體VH和

7、VL基因全長分別為342和332個(gè)bP，可分別編碼114和110個(gè)氨基酸。VH基因與基因庫中小鼠IgVH基因的同源性高達(dá)98％，氨基酸與小鼠Ig的同源性達(dá)86％，應(yīng)歸屬于小鼠IgVH基因。VL基因與基因庫中的小鼠IgVL基因的同源性達(dá)99％，氨基酸與小鼠IgVL氨基酸的同源達(dá)95％，應(yīng)歸屬于小鼠IgVL基因。采用SOE-PCR法構(gòu)建了抗氯嘧磺隆單鏈抗體基因，在其兩端分別加上了Xho1和ECoR1酶切位點(diǎn)，該基因長719bp，可編碼239