玉米赤霉烯酮單克隆抗體的制備及噬菌體單鏈抗體的篩選.pdf

1、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的真菌毒素，主要污染玉米、大麥、小麥、燕麥和高粱等作物。ZEN除具有很強雌激素樣作用可產(chǎn)生生殖毒性外，還具有免疫毒性、肝毒性、遺傳毒性、潛在致癌性。該毒素可通過污染了ZEN的谷物及其制品或者殘留有ZEN的肉、奶等進入動物和人體內(nèi)，給畜牧業(yè)和人類健康造成威脅。
　　對ZEN進行及時準確的檢測是預(yù)防和控制其危害的有效手段。我國《GB13078.2-2006飼料衛(wèi)生標(biāo)準-

2、飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》要求，配合飼料、玉米中的ZEN允許量為500μg/kg。2011年出臺的《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》中規(guī)定了谷物及其制品中ZEN限量為60μg/kg。只有根據(jù)國家標(biāo)準對飼料和谷物及其制品中的ZEN進行準確有效的檢測才能從源頭上杜絕ZEN對畜牧行業(yè)和人類健康的威脅。目前，用于檢測ZEN的方法有高效液相色譜法、氣相色譜、薄層層析法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及免疫學(xué)檢測方法等。其中免疫

3、學(xué)檢測方法的前處理簡單、操作易掌握而且便特異性強、靈敏度高。這使得免疫學(xué)檢測方法成為被廣泛應(yīng)用的檢測方法。
　　高品質(zhì)抗體是免疫學(xué)檢測方法的基礎(chǔ)，本試驗制備了可穩(wěn)定分泌抗ZEN的單克隆抗體細胞株，并從雜交瘤細胞株中提取RNA，通過基因工程技術(shù)獲得了抗ZEN陽性噬菌體單鏈抗體，為從基因工程抗體途徑獲得ZEN免疫學(xué)檢測中所需要的高品質(zhì)抗體奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗Ⅰ玉米赤霉烯酮單克隆抗體制備本試驗用ZEN與羧甲基羥胺半鹽酸鹽在吡啶中

4、反應(yīng)生成玉米赤霉烯酮肟(ZEN-CMO)，用紫外連續(xù)波譜掃描法對ZEN-CMO進行鑒定，同時計算ZEN-CMO的肟化率;用活性酯法將ZEN-CMO與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)合成免疫抗原;用醛法將ZEN與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)合成包被抗原，用紫外連續(xù)波譜掃描法對免疫抗原與包被抗原進行鑒定;通過常規(guī)免疫和聯(lián)合脾內(nèi)免疫獲得的BALB/c小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合，用間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞，間接競爭ELISA檢測其特異性。結(jié)果表

5、明:ZEN-CMO合成成功，肟化率為65.0％;免疫抗原與包被抗原合成成功;篩選到一株陽性雜交瘤細胞將其命名為4C8;經(jīng)鑒定4C8抗體亞型為IgG2b，輕鏈為κ鏈;染色體平均計數(shù)為104條;SDS-PAGE電泳呈現(xiàn)約為25kDa、50kDa的兩條蛋白條帶;間接ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清的效價為1∶512，腹水效價為1∶9600，純化腹水蛋白濃度為1.639g/L;細胞培養(yǎng)上清對ZEN具有特異性。以上結(jié)果說明:雜交瘤細胞株4C8可用于玉米

6、赤霉烯酮單鏈抗體的制備。
　　試驗Ⅱ玉米赤霉烯酮噬菌體單鏈抗體的篩選與表達從已篩選得到的雜交瘤細胞提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增出重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL，將Linker與VH、VL通過SOE-PCR按VH-Linker-VL方式拼接成scFv片段，將scFv基因和pCANTAB5E載體分別用sfiⅠ和NotⅠ雙酶切后連接并轉(zhuǎn)化E.coliTG1，經(jīng)過輔助噬菌體M13K07的挽救，構(gòu)建噬菌體單鏈抗體的初級抗體庫;以ZEN-

7、OVA為包被抗原，進行富集篩選，將陽性噬菌體抗體庫上清感染E.coliHB2151用IPTG誘導(dǎo)表達。結(jié)果表明:經(jīng)過3輪的親和富集后抗體庫總富集倍數(shù)達到66.2倍，滴度達到3.7×106cfu/mL，通過phage-ELISA篩選出3株特異性抗ZEN的單鏈抗體菌株;用IPTG成功誘導(dǎo)表達35kDa左右的可溶性目的蛋白，用BandScan軟件分析目的蛋白表達量，確定最佳誘導(dǎo)溫度為30℃，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/mL，最佳誘導(dǎo)