桔青霉素單克隆抗體和單鏈抗體的篩選及鑒定研究.pdf

1、桔青霉素(citrinin，CIT)是由青霉屬和曲霉屬等真菌產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種農(nóng)產(chǎn)品和食品中。早年間，桔青霉素因?yàn)榫哂休^好的抑菌效果，曾被作為抗生素進(jìn)行使用，但后來(lái)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它也具有強(qiáng)烈的腎毒性和致癌性，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物的健康。因此，建立一套針對(duì)桔青霉素殘留的檢測(cè)方法顯得非常必要，而制備抗桔青霉素的特異性抗體對(duì)于臨床檢測(cè)方法的建立則具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用化學(xué)偶聯(lián)方法分別制備了桔青霉素人工完全抗原CIT-BS

2、A和CIT-OVA:采用細(xì)胞融合技術(shù)獲得了抗桔青霉素的雜交瘤細(xì)胞株3B11及其單克隆抗體;根據(jù)基因工程原理構(gòu)建了大容量、天然鼠源核糖體展示(Ribosome display, RD)單鏈抗體(Single-Chain Fragment Variant，scFv)文庫(kù);運(yùn)用核糖體展示技術(shù)篩選到了抗桔青霉素的單鏈抗體基因。研究成果為桔青霉素的殘留檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。
　　1.桔青霉素完全抗原的合成與鑒定
　　桔青霉素屬于小分子半抗原

3、，不具有免疫原性，無(wú)法直接用來(lái)對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫制備抗體，所以，必須首先通過(guò)與蛋白載體進(jìn)行偶聯(lián)制成人工完全抗原。本研究采用碳二亞胺法，利用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀亞胺(NHS)作為偶聯(lián)劑，牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清白蛋白(OVA)作為蛋白載體，分別制備了CIT-BSA和CIT-OVA人工完全抗原，并使用紫外光譜分析、SDS-PAGE以及MALDI-TOF質(zhì)譜法分別對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)前后物質(zhì)進(jìn)行鑒定。鑒定

4、結(jié)果顯示人工完全抗原CIT-BSA成功偶聯(lián)，CIT與BSA的偶聯(lián)比例約為5∶1，可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行免疫制備相應(yīng)的抗體。
　　2.桔青霉素單克隆抗體的制備及鑒定
　　為制備抗桔青霉素的單克隆抗體，本研究利用所制備的偶聯(lián)抗原CIT-BSA對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行免疫，取免疫后的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行篩選，經(jīng)3次亞克隆后篩選到5株穩(wěn)定分泌抗桔青霉素抗體的雜交瘤

5、細(xì)胞株，分別為2A9、3B5、3B11、3C5、6C1。所篩選到的單克隆抗體經(jīng)過(guò)初步鑒定，抗體亞類分別有IgM、IgG1、IgG2a;經(jīng)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法鑒定，單克隆抗體3B11對(duì)桔青霉素的IC50值為150.9 ng/mL，最低檢測(cè)限IC10為5.42 ng/mL;與展青霉毒素(PAT)、黃曲霉毒素(AFB1)、伏馬毒素(FB1)和赭曲霉毒素(OTA)的交叉反應(yīng)率均低于0.01％;抗體親和力常數(shù)為7.75×107 L/moL，

6、屬于高親和力抗體。本實(shí)驗(yàn)所制備的單抗具有較好的抑制效果、靈敏性和特異性，為快速檢測(cè)桔青霉素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立和檢測(cè)試劑盒的研制提供了技術(shù)依據(jù)。
　　3.大容量天然鼠源核糖體展示單鏈抗體文庫(kù)的構(gòu)建與初步鑒定
　　為構(gòu)建大容量天然鼠源核糖體展示(Ribosome display, RD)單鏈抗體(Single-Chain Fragment Variant, scFv)基因文庫(kù)，本研究通過(guò)提取SPF級(jí)小鼠脾臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄

7、為cDNA，分別利用引物擴(kuò)增鼠抗體的VH、VL和Cκ基因，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)方法，通過(guò)Linker（(Gly4Ser)3)相互拼接，構(gòu)建了單鏈抗體scFv基因文庫(kù)和核糖體展示基因文庫(kù);經(jīng)連接轉(zhuǎn)化，對(duì)所構(gòu)建基因文庫(kù)進(jìn)行菌落PCR鑒定、序列測(cè)定和比對(duì)分析。所構(gòu)建核糖體展示基因文庫(kù)庫(kù)容量約為5.6×1013，基因片段全長(zhǎng)大小約為1100 bp，基因文庫(kù)序列具有較好的完整性和多樣性。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了一個(gè)大容量天然鼠源核糖體展示

8、單鏈抗體文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選單鏈抗體奠定了基礎(chǔ)。
　　4.核糖體展示技術(shù)篩選抗桔青霉素的特異性單鏈抗體
　　為獲得桔青霉素特異性單鏈抗體，本研究在所構(gòu)建的鼠源天然核糖體展示基因文庫(kù)的基礎(chǔ)上，采用核糖體展示技術(shù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，分別以人工完全抗原CIT-BSA、CIT-OVA和蛋白載體BSA、OVA為包被抗原，采用間接ELISA方法對(duì)其進(jìn)行篩選，親和篩選所獲得的mRNA運(yùn)用真核原位RT-PCR方法進(jìn)行回收，所獲得的cDNA利用

9、表達(dá)載體pTIG-TRX在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行可溶性表達(dá)，并利用間接ELISA方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。經(jīng)過(guò)六輪親和篩選和間接ELISA方法鑒定，共獲得13個(gè)單鏈抗體基因，其中3個(gè)單鏈抗體(編號(hào)分別為23、68、109)與CIT具有較高的結(jié)合能力;間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，68號(hào)單鏈抗體對(duì)CIT的IC50值為1242.2 ng/mL，最低檢測(cè)限LOD∶IC10為3.1 ng/mL;并且與展青霉毒素（PT）、黃曲霉毒素(AFB1)、伏馬毒素