肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及其兔單克隆抗體的篩選和鑒定.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,每年全世界死于肝癌的患者約達(dá)125萬人,中國是肝癌高發(fā)區(qū),占世界上肝癌總死亡人數(shù)的53﹪.因此尋找肝癌不同發(fā)展階段的特異性、相關(guān)性蛋白,進(jìn)行肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后方面的研究尤為重要,據(jù)此不僅可以進(jìn)行早期診斷,判斷預(yù)后,還有助于篩選新的藥物靶點(diǎn),開發(fā)新的治療藥物和治療手段,降低肝癌的死亡率.蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種新興的技術(shù),已成為疾病發(fā)病

2、機(jī)理以及新藥研發(fā)的強(qiáng)有力工具.目前疾病蛋白質(zhì)組學(xué)所依賴的技術(shù)平臺仍然以2DE-MS為主,即首先應(yīng)用2DE比較正常狀態(tài)與疾病狀態(tài)的蛋白組,通過差異圖譜發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白,然后用MS對這些差異蛋白進(jìn)行鑒定,并從這些差異蛋白出發(fā)進(jìn)一步研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)理、診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn).雖然2DE目前仍是應(yīng)用最廣泛的一種技術(shù)路線,但其分離能力有一定限度,重復(fù)性差,難以檢測到對生理和病理過程具有關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用的低豐度和難溶水的蛋白.因此目前國際上開始重視

3、研究以高效液相色譜方法(HPLC)為主的技術(shù)平臺,特別是與各種模式質(zhì)譜串聯(lián)的多維色譜分離技術(shù)逐漸克服2DE存在的缺陷.通常與質(zhì)譜聯(lián)用的多維色譜分離方法是基于兩種或兩種以上不同分離機(jī)理方法的優(yōu)化和組合,其分離量為幾種模式色譜分離量的總和.二維液相色譜分離法包括液相狀態(tài)下的色譜聚焦(第一維)及無孔硅膠反向HPLC分離(第二維).從第二維洗脫的蛋白質(zhì)可用電噴霧離子阱質(zhì)譜(ESI-MS)直接檢測,或用基質(zhì)輔助激光解析質(zhì)譜(MALDI-MS)測定

4、分離蛋白的完整分子量.該方法具有幾個重要的優(yōu)點(diǎn):(1)靈敏度高,有利于低豐度蛋白質(zhì)的檢測,無孔硅膠柱的無孔鍵合相更有利于蛋白質(zhì)的快速、高分辨的分離;(2)容易自動化,可直接與質(zhì)譜連接,二維液相色譜分離方法可提供溶液狀態(tài)下的純蛋白,因此可以使用ESI-MS或MALDI-MS分析而獲得高精確的完整蛋白質(zhì)的分子量;(3)分辨率高,可獲得更精細(xì)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜信息;(4)重現(xiàn)性很好.應(yīng)用二維液相快速色譜分離方法研究蛋白質(zhì)組差異將成為尋找癌癥等疾病

5、分子標(biāo)記和藥物靶標(biāo)最有效的方法之一.肝細(xì)胞肝癌的高復(fù)發(fā)率已經(jīng)成為進(jìn)一步提高思者術(shù)后長期生存率的最大障礙.所以肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究具有十分重要的意義.復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所近年來建立了人的高、低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-H和MHCC97-L.MHCC97-H表現(xiàn)出100﹪的肺轉(zhuǎn)移能力,而MHCC97-L僅發(fā)生40﹪的肺轉(zhuǎn)移.該模型為研究肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ).我們利用二維液相色譜分離法對人不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組分析

6、,并對其中的差異峰進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定及功能分析.Kohler和Milstein于1975年創(chuàng)立的單克隆抗體雜交瘤技術(shù)不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元,也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具.1 995年,Knight成功地在轉(zhuǎn)基因兔中獲得骨髓瘤樣腫瘤(plasmacytoma).其后幾年里,Pytela和Zhu將此技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),使之能高產(chǎn)量的生產(chǎn)兔單克隆抗體.兔單克隆抗體的出現(xiàn)帶來了許多好處.首先,兔抗血清通常含有高親合力抗體,可以

7、比鼠抗血清識別更多種類的表位;其次,兔單克隆抗體能夠識別許多在小鼠中不產(chǎn)生免疫的抗原;第三,可以進(jìn)行更多的融合實(shí)驗(yàn),使得高通量篩選融合細(xì)胞成為可能;第四,復(fù)合方式高通量生產(chǎn)單克隆抗體,允許通過一個復(fù)合方式免疫多種抗原,而不是一個抗原一次免疫一個動物.雖然可以用混合抗原一次性免疫一個動物以產(chǎn)生針對多種抗原的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,但是如何確定每種單克隆抗體的靶抗原卻是一個難題.我們將二維液相色譜法分離的肝癌細(xì)胞株的全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,

8、并用雜交瘤的上清液進(jìn)行western blot分析,再對單克隆抗體所對應(yīng)的靶抗原的條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定.這樣就大大提高了單克隆抗體的篩選效率,也將加速疾病目標(biāo)蛋白的證明和檢驗(yàn)的過程,并為進(jìn)一步研究其功能提供了有利的工具.研究目的1、篩選和鑒定肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白,評價其作為診斷標(biāo)記和藥物靶標(biāo)的可能性;2、篩選和鑒定肝癌特異性兔單克隆抗體.研究方法1、細(xì)胞樣品的制備收集不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株(高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-H、低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株M

9、HCC97-L和無轉(zhuǎn)移特性的肝癌細(xì)胞株SMMC7721)約108細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解緩沖液,上清用初始緩沖液置換.BCA法測定蛋白濃度.2、二維液相色譜分離利用二維液相色譜儀PROTEMELABTM PF2D和其配套試劑盒(貝克曼庫爾特公司)進(jìn)行不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株裂解液的蛋白質(zhì)組差異分析.一維色譜聚焦分析流動相為初始緩沖液(pH值8.5±0.1)、洗脫緩沖液(pH值4.0±0.1),流速為0.2 mL/min;檢測波長為280 nm

10、;流動相的pH值由pH計在線監(jiān)測,每間隔0.3個pH單元收集一份樣品,共收集15個樣品.pH值大于8.5和小于4.0的部分每隔5 min收集一次樣品.將一維分離的樣品分別進(jìn)行二維分析,流動相A為0.10﹪TFA的水溶液,流動相B為0.08﹪TFA的乙腈溶液;檢測波長為UV 214 nm;洗脫梯度為0-100﹪B,30 min.3、差異蛋白的質(zhì)譜鑒定收集差異蛋白進(jìn)行胰酶酶解,MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析,MSFit軟件分析系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)

11、和數(shù)據(jù)庫查詢,對差異蛋白進(jìn)行功能分析,并對部分差異蛋白用間接免疫熒光法進(jìn)行驗(yàn)證.4、動物免疫和雜交瘤細(xì)胞的融合肝癌患者的腫瘤組織,液氮研磨法制備免疫兔的混合抗原.送到美國Epitomics公司進(jìn)行動物免疫和雜交瘤細(xì)胞的融合.用HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后,改用HT培養(yǎng)液,再維持培養(yǎng)兩周.5、雜交瘤細(xì)胞的克隆化和單克隆抗體的初篩用有限稀釋法將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化,用高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-H和正常永生化肝細(xì)胞株L-02種96孔板,

12、免疫熒光法檢測上清中的抗體,將陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存.6、兔單克隆抗體靶抗原的鑒定將MHCC97-H和L-02細(xì)胞株的全蛋白裂解液進(jìn)行SDS-PAGE,用抗體陽性的雜交瘤上清作為一抗進(jìn)行western blot,選擇與MHCC97-H和L-02差異反應(yīng)的單抗進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.將HPCF一維分離的MHCC97-H的15~20個pI組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后用待鑒定的抗體作Western blot,陽性條帶進(jìn)行膠內(nèi)酶解

13、,質(zhì)譜鑒定.若條帶難以分開,則選擇相應(yīng)的pI組分進(jìn)行HPLC二維分離后再進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western-blot及質(zhì)譜鑒定.研究結(jié)果1.我們利用二維液相色譜分離法對三株不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株進(jìn)行了差異蛋白質(zhì)組分析,并對其中的差異峰進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定.我們鑒定了15個樣品,其中5個樣品用MALDI-TOFMS鑒定沒有信號,下一步將選用ESI-MS進(jìn)一步鑒定.鑒定的10個樣品中有兩個為未知蛋白.(A)在轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)的

14、有HSP60、ATP synthase alpha subunit和Synaptotagmin 1 2.Synaptotagmin 1 2是一種突觸蛋白,與軸漿運(yùn)輸有關(guān).(B)在MHCC97-H中上調(diào)的有annexin、cytokeratin19、glyceraldehydes 3phosphate dehydrogenase(G3PDH)和RNA-binding proteinregulatory subunit.cytokerati

15、n19的過表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān).RNA-bindingprotein regulatory subunit(oncogene DJ1)與c-myc蛋白有相互作用,被認(rèn)為是一個依賴于有絲分裂原的癌基因產(chǎn)物,參與Ras相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.G3PDH是與代謝有關(guān)的酶,也可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移.(C)在SMMC7721中上調(diào)的有Protein disulfideisomerase A3 precursor,為二硫鍵異構(gòu)酶前體,在人肝蛋白質(zhì)組數(shù)

16、據(jù)庫中已有收錄,且在乳腺癌和結(jié)腸癌中表達(dá)異常.用間接免疫熒光法對HSP60差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明HSP60存在于細(xì)胞胞漿內(nèi),在MHCC97-H和MHCC97-L中為陽性,而在SMMC7721中不表達(dá).下一步將對其它蛋白分別用定量RT-PCR和免疫組化法分別在基因水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證.2.在人肝癌組織抗原制備的兔雜交瘤實(shí)驗(yàn)中,目前已得到32株能分泌抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株,已鑒定了其中的一株的靶抗原為Reticulocalbin