單克隆抗體相關(guān)內(nèi)容

1、有夢(mèng)想，才會(huì)有創(chuàng)造！,生物種間雜交想像圖,已成功的動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)例有很多，如人—小鼠、人—兔、人—雞、鼠—兔、雞—鼠等上百種融合細(xì)胞。甚至已成功完成了酵母菌—雞 、人—胡蘿卜 等細(xì)胞的融合。,一、植物細(xì)胞雜交過程,二、動(dòng)物細(xì)胞融合,三、多克隆抗體,1.單克隆抗體的制備,2.單克隆抗體的優(yōu)缺點(diǎn),3.單克隆抗體的應(yīng)用,主 要 內(nèi) 容,,四、單克隆抗體,原生質(zhì)體融合,雜合的原生質(zhì)體,再生出細(xì)胞壁,雜種細(xì)胞,脫分化,再分化,愈傷組織,雜種植株,

2、一、植物體細(xì)胞雜交過程,纖維素酶、果膠酶,,1970年，有兩位科學(xué)家做了一個(gè)人—鼠細(xì)胞融合的實(shí)驗(yàn)，以證明細(xì)胞膜的流動(dòng)性。那么，如何實(shí)現(xiàn)人—鼠細(xì)胞的融合，動(dòng)物細(xì)胞融合后還有什么用途呢？,人-鼠(想像圖),二、動(dòng)物細(xì)胞融合,1.概念：,動(dòng)物細(xì)胞融合（cell fusion）也成細(xì)胞雜交，是指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程。,融合和形成的具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。,2、原理：,細(xì)胞膜的流動(dòng)性,有些細(xì)胞的

3、融合是正常的生命活動(dòng)，如精子與卵細(xì)胞的結(jié)合。,3.誘導(dǎo)方法：,,物理方法：,化學(xué)法：,生物法：,滅活的病毒,離心、振動(dòng)、電激等,聚乙二醇（PEG),為什么滅活的病毒能作誘導(dǎo)劑？不滅活的病毒能作為誘導(dǎo)劑嗎？,,4.融合過程,為什么滅活的病毒能作為誘導(dǎo)劑？不滅活的病毒能作為誘導(dǎo)劑嗎？,生物法：,滅活的病毒,喪失感染性,（不感染細(xì)胞）,保留融合活性,仙臺(tái)病毒,紫外線,,,,,兩個(gè)核的融合是在雜種細(xì)胞第一次有絲分裂時(shí)進(jìn)行的,4.意義：,突破了

4、有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動(dòng)植物之間）成為可能。,5.應(yīng)用：,最重要的用途是制備單克隆抗體,植物細(xì)胞雜交與動(dòng)物細(xì)胞融合的比較,細(xì)胞膜的流動(dòng)性 細(xì)胞的全能性,細(xì)胞膜的流動(dòng)性,纖維素酶、果膠酶,胰蛋白酶,物理方法（離心、振蕩、電激） 化學(xué)方法（PEG）,物理、化學(xué)方法 滅活的病毒,去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合,使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合,,,定義： 采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質(zhì)經(jīng)不同

5、途徑注入動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)數(shù)次免疫后采取動(dòng)物血液，分離血清，所獲得的抗體即為多克隆抗體。 無(wú)論是細(xì)菌抗原，還是病毒抗原，均由多種抗原成分組成，因此進(jìn)入機(jī)體后可激活多種淋巴細(xì)胞克隆，機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)各種抗原成分或抗原決定簇的抗體，由此獲得的抗體實(shí)際是一種多克隆的混合抗體。,三、多克隆抗體,什么叫克??？2.什么叫抗體？抗體由何種細(xì)胞產(chǎn) 生？如何產(chǎn)生？3.抗體的化學(xué)本質(zhì)是什么？ 與抗原作用的特點(diǎn)？ 主要分布

6、在哪里？4.用傳統(tǒng)的方法如何獲得抗體？,四、單克隆抗體,抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法,從血清中分離抗體,該法制備抗體的特點(diǎn)： 產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。,多種效應(yīng)B細(xì)胞,動(dòng)物體內(nèi),,多種抗體,抗原,,,,單克隆抗體McAb（概念）,由單個(gè)B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無(wú)性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。,那么，如何大量獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體？（即單克隆抗體）

7、,1.單克隆抗體的制備,單克隆抗體制備技術(shù)發(fā)展,1975 年德國(guó)科學(xué)家Kohler 和英國(guó)科學(xué)家Milstein利用雜交瘤技術(shù)將產(chǎn)生抗體的B 淋巴細(xì)胞同骨髓瘤細(xì)胞融合，成功的建立了單克隆抗體制備技術(shù)，由于單克隆抗體在生命科學(xué)領(lǐng)域的巨大貢獻(xiàn)，此技術(shù)獲得1984 年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。1994年Winter 等創(chuàng)建了以噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)為代表的基因工程抗體，是單克隆抗體技術(shù)的又一重要進(jìn)步， 該技術(shù)是按人工設(shè)計(jì)所重新組裝的新型抗體

8、分子，使不經(jīng)免疫既可獲得任何一種動(dòng)物（包括人）的特異性抗體成為可能，目前基因工程抗體在疾病的預(yù)防、診斷、及治療方面已獲得廣泛應(yīng)用。,單克隆抗體技術(shù)的基本原理,小鼠受到外界抗原刺激后可誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這一職能是由B 淋巴細(xì)胞來承擔(dān)的；腫瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)的條件下可以無(wú)限傳代，是“永久”的細(xì)胞。把小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)免疫過的小鼠的脾細(xì)胞在聚乙二醇等介導(dǎo)下發(fā)生融合，融合后的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性，一方面可以分泌特定的抗體

9、,另一方面也具備了腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的能力, 可在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)無(wú)限增殖, 從而分泌大量單克隆抗體。,一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無(wú)限增殖,,雜種細(xì)胞,,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),設(shè)計(jì)方案,動(dòng)物細(xì)胞融合,單克隆抗體,既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖,過程,注射抗原,,細(xì)胞融合、篩選,篩選，繼續(xù)培養(yǎng),足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群,,,單克隆抗體,選擇性培養(yǎng)基,選擇性培養(yǎng)基作用：使親本細(xì)胞和具有同種核

10、的雜交細(xì)胞不能存活而雜交瘤細(xì)胞可存活,,,誘導(dǎo)其融合的方法有哪些？,,抗體檢驗(yàn)陽(yáng)性,細(xì)胞系（無(wú)限繁殖),,,,,單克隆抗體制備過程,,,單克隆抗體的制備,為什么用HAT培養(yǎng)基可篩選出雜交瘤細(xì)胞？,HAT選擇性培養(yǎng)基,制備單克隆抗體的方法是用缺乏次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤細(xì)胞變異株與脾臟的B細(xì)胞融合。采用HAT選擇性培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加次黃嘌呤，氨基喋呤及胸腺嘧啶核苷），在這種選擇性培養(yǎng)基中，由于變異的瘤細(xì)胞不具有次黃

11、嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷酸單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基喋呤所阻斷，所以未融合的瘤細(xì)胞不可避免也要死亡。融合的雜交瘤細(xì)胞由于脾淋巴細(xì)胞具有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶，可以通過次黃嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻斷，因此雜交瘤細(xì)胞大量繁殖而被篩選出來。B淋巴細(xì)胞在一般培養(yǎng)基中不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)，一般于二周內(nèi)均死亡。,,如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體 檢

12、測(cè)及克隆化培養(yǎng)？,融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。 將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4

13、次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。,有限稀釋法 將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使 每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測(cè)各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽(yáng)性孔。,陽(yáng)性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤

14、細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。,2.單克隆抗體的優(yōu)缺點(diǎn),總之：特異性強(qiáng)、靈敏度高，產(chǎn)量大,(1)雜交瘤可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細(xì)胞株的基因突變，就可以不斷地生產(chǎn)高特異性、高均一性的抗體。 (2)可以用相對(duì)不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。 (3)由于可能得到“無(wú)限量”的均一性抗體，所以適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法，如IRMA和ELISA等。 (4)由于單克隆抗體的

15、高特異性和單一生物學(xué)功能，可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導(dǎo)向治療。,優(yōu)點(diǎn)：,,,(1)單克隆抗體固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應(yīng)用范圍。由于單克隆抗體不能進(jìn)行沉淀和凝集反應(yīng)，所以很多檢測(cè)方法不能用單克隆抗體完成。 (2)單克隆抗體的反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體。 (3)制備技術(shù)復(fù)雜，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)工，所以單克隆抗體的價(jià)格也較高。,單克隆抗體的局限性,化療是治療癌癥的常用手段。但是化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)會(huì)破壞正常細(xì)胞

16、產(chǎn)生巨大的副作用。如何在早期對(duì)癌癥進(jìn)行檢測(cè)和篩查？如何能讓藥物只作用于癌細(xì)胞？,3.單克隆抗體的應(yīng)用,3.單克隆抗體的應(yīng)用,（1）作為診斷試劑——準(zhǔn)確識(shí)別各種抗原物質(zhì)，并與抗原特異性結(jié)合，最廣泛應(yīng)用。 準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速,單克隆抗體運(yùn)載抗癌藥物，形成“生物導(dǎo)彈”（分子靶向治療），治療腫瘤。,（2）運(yùn)載藥物和治療疾病,生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物，治療腫瘤,(“生物導(dǎo)彈” —單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭),“生物導(dǎo)彈”為人類攻克

17、癌癥提供了新的希望，但到目前為止只在少數(shù)癌癥的治療中有成功的范例，相信在不久的將來，因?yàn)槲覀兊牟粩嗵剿?，人類最終會(huì)解決這一難題！ 目前，如何提高抗體的生產(chǎn)效率，同時(shí)保持其優(yōu)良特性，且能同時(shí)解決免疫原性這一問題，是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，相信不久的將來，隨著重組DNA 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，可以根據(jù)不同需要實(shí)現(xiàn)人-人、人-動(dòng)物、人-植物和動(dòng)物-動(dòng)物等多種抗體重新組合，借助于雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生嵌合抗體、重組型抗體、單鏈抗體、單區(qū)抗體、全套抗體以