肝癌相關(guān)基因HTA的重組表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、目的:本研究將肝癌相關(guān)基因(HTA)進(jìn)行重組表達(dá)并制備抗HTA單克隆抗體,初步分析HTA蛋白功能及其表達(dá)譜,為進(jìn)一步研究其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為肝癌診斷標(biāo)志和潛在免疫治療靶點(diǎn)的可行性及臨床意義奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增獲得HTA338-616DNA,將其克隆到原核表達(dá)載體pET21a(+)-MBP,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)MBP-HTA融合蛋白及MBP蛋白,His-tag磁

2、珠純化試劑盒純化兩種蛋白,并用ELISA法進(jìn)行活性鑒定。分別用MBP、MBP-HTA蛋白刺激并培養(yǎng)HepG2細(xì)胞,采用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激前后細(xì)胞周期分布的改變。用純化的重組蛋白MBP-HTA免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備抗HTA單克隆抗體,并用ELISA和Western blot的方法檢測抗體的靈敏度和特異性,采用免疫組織化學(xué)法分析HTA蛋白的表達(dá)譜。
　　 結(jié)果:
　

3、　 1.應(yīng)用RT-PCR技術(shù),從人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增得到大小約為300bp的HTA338-616DNA片段。通過PCR鑒定、酶切鑒定和DNA測序表明:成功地構(gòu)建了表達(dá)MBP-HTA融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET21a(+)-MBP-HTA。
　　 2.通過IPTG誘導(dǎo),重組MBP-HTA融合蛋白在表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)內(nèi)得以高效表達(dá),主要以包涵體的形式存在。通過His-tag磁珠純化試劑盒純化和Wes

4、tern blot分析,得到了分子量約為52kDa的目的蛋白。
　　 3.MTT及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示:與MBP蛋白刺激后的HepG2細(xì)胞及陰性對照組相比,MBP-HTA蛋白刺激后的HepG2細(xì)胞增殖明顯;流式細(xì)胞術(shù)顯示:MBP-HTA蛋白刺激后的HepG2細(xì)胞G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增多,細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。
　　 4.制備獲得高效價(jià)的特異性抗HTA單克隆抗體。經(jīng)ELISA檢測抗體的效價(jià)為1:12800,用Western

5、 blot檢測的效價(jià)為1:1600。用免疫組織化學(xué)法分析HTA蛋白在不同組織中的表達(dá)情況顯示:HTA蛋白在肝癌、肝硬化、肝纖維化、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、肺癌、宮頸癌、正常肝臟、正常結(jié)腸組織中均有表達(dá),且陽性染色主要見于胞質(zhì)和胞膜,而在其他被檢測組織中尚未觀察到陽性表達(dá),其中在肝癌中陽性表達(dá)率較高,明顯高于其在肝硬化、肝纖維化及正常肝組織中的陽性表達(dá)率。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建了表達(dá)MBP-HTA融合蛋白的原核表

6、達(dá)質(zhì)粒pET21a(+)-MBP-HTA,MBP-HTA重組蛋白分子量約52kDa。
　　 2.獲得的重組蛋白MBP-HTA有較強(qiáng)的免疫原性。
　　 3.HTA蛋白可以明顯的促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖,這可能與其促進(jìn)細(xì)胞從G1期過渡到S期有關(guān)。
　　 4.成功制備抗HTA單克隆抗體,該抗體有較高的效價(jià)和特異性;能用于免疫組織化學(xué)的檢測,且HTA蛋白在肝癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于其在肝硬化、肝纖維化及正常肝組織中的陽