人肝素酶重組蛋白的表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、研究背景和目的
　　 惡性腫瘤是當(dāng)前嚴(yán)重影響人類健康的最重要的疾病之一。而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤的轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜,目前認(rèn)為轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移主要通過以下三個(gè)步驟:1.腫瘤細(xì)胞通過細(xì)胞表面受體和細(xì)胞基質(zhì)成分的粘附蛋白首先發(fā)生特異性結(jié)合,2.細(xì)胞外基質(zhì)的水解酶降解過程,3.降解區(qū)發(fā)生瘤細(xì)胞的移動(dòng)與侵襲。其中參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解過程中起作用的因素備受重視。
　　 肝素酶是1999年由四個(gè)

2、不同的實(shí)驗(yàn)室克隆成功的一種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,肝素酶(heparanase,Hpa)是唯一能裂解ECM內(nèi)蛋白多糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG)的內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶。研究表明肝素酶可以通過降解HSPG途徑破壞ECM、BM的完整性以及促進(jìn)腫瘤新生血管的生成而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。越來越多的研究證實(shí),肝素酶在幾乎所有的中晚期惡性腫瘤中都高表達(dá),與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān),抑制肝素酶

3、的表達(dá)可以明顯減少腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,肝素酶有可能作為腫瘤診斷與治療的新靶點(diǎn)。
　　 單克隆抗體(Monoclonal Antibody,McAb)是單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體?？贵w主要由B淋巴細(xì)胞合成,每個(gè)B淋巴細(xì)胞有合成一種抗體的遺傳基因。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí),抗原分子上的許多決定簇分別激活各個(gè)具有不同基因的B細(xì)胞。被激活的B細(xì)胞分裂增殖形成該細(xì)胞的子孫,即克隆。如果選出一個(gè)合成一種抗體的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),就可得到由單細(xì)胞

4、經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群,即單克隆。單克隆細(xì)胞所合成的抗體即為單克隆抗體。1975年Kohler和Milstein首先報(bào)道,用細(xì)胞雜交技術(shù),使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)免疫的小鼠脾細(xì)胞,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,創(chuàng)建了第一個(gè)B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株,獲得了抗SRBC的單克隆抗體。這是免疫學(xué),乃至醫(yī)學(xué)史上的一個(gè)里程碑。單克隆抗體的特點(diǎn)是:理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制,并且來源容易。這些優(yōu)點(diǎn)使它一問世就受到

5、高度重視,并成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段。單克隆抗體具有高度特異性、高純度特點(diǎn),使其在很大濃度范圍內(nèi)獲得低背景,所以在組織免疫染色中特別有用,還可以應(yīng)用于免疫沉淀,免疫印跡技術(shù),并且都具有特異性高,背景低的優(yōu)點(diǎn)。另外單抗還可以用來進(jìn)行免疫親和純化抗原;對(duì)單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記還可以用做快速診斷以及疫苗的研究等。目前有關(guān)肝素酶的單克隆抗體多見于國(guó)外公司生產(chǎn),我國(guó)尚無商品化的肝素酶單克隆抗體。單純的從國(guó)外進(jìn)口該抗體,價(jià)格昂貴,成

6、本高。
　　 基于以上認(rèn)識(shí),本研究擬構(gòu)建人肝素酶高效表達(dá)基因,以獲得人肝素酶重組蛋白,再利用獲得的高純度肝素酶蛋白作為免疫原,采用常規(guī)免疫程序和雜交瘤技術(shù)篩選人肝素酶特異性單克隆抗體,并利用免疫組化、ELISA及Western Blot等技術(shù)對(duì)獲得的人肝素酶單克隆抗體進(jìn)行鑒定,最后獲得人肝素酶特異性的單克隆抗體,為以后肝素酶單克隆抗體在臨床診斷以及抗體介導(dǎo)的腫瘤靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法
　　 1.將人肝

7、素酶全長(zhǎng)cDNA克隆到pET30a質(zhì)粒,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá),采用Ni2+柱純化對(duì)人肝素酶重組蛋白進(jìn)行純化,對(duì)表達(dá)的人肝素酶重組蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析;
　　 2.將獲得的肝素酶蛋白作為免疫源免疫Balb/c小鼠獲得經(jīng)免疫后能產(chǎn)生肝素酶抗體的B淋巴細(xì)胞:采用雜交瘤技術(shù)制備分泌肝素酶抗體的雜交瘤細(xì)胞株;采用有限稀釋法篩選分泌抗體呈強(qiáng)陽(yáng)性的克隆,并對(duì)上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè),鑒定篩選出的陽(yáng)性克隆;
　　

8、 3.采用HIS親和層析以及復(fù)性純化技術(shù)純化肝素酶單克隆抗體;獲得的抗體采用Western Blot技術(shù)、免疫組化技術(shù)及ELISA技術(shù)檢測(cè)制備的肝素酶單克隆抗體的特異性和抗體的效價(jià)。
　　 結(jié)果
　　 1.我們采用PCR技術(shù)克隆了人肝素酶蛋白編碼基因。經(jīng)測(cè)序與GENBANK提供的基因序列完全一致。將克隆的人肝素酶基因序列克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a構(gòu)建人肝素酶原核表達(dá)重組質(zhì)粒;經(jīng)1.0mmol/L IPTG37℃誘導(dǎo)

9、表達(dá)5h,pET30a-Hpa在BL21中表達(dá)融合蛋白,分子量為63KD左右,表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上。經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白破菌后主要在沉淀中,為包涵體表達(dá)。采用HIS親和層析及復(fù)性純化方法,純化獲得人肝素酶重組蛋白;
　　 2.利用純化的人肝素酶蛋白免疫原采用常規(guī)免疫程序和雜交瘤技術(shù),經(jīng)細(xì)胞融合,篩選出15株抗人肝素酶的特異性單克隆抗體,經(jīng)亞類鑒定其中有3株為適合應(yīng)用于診斷試劑的IgG1;
　　 3.經(jīng)免疫組化、ELI

10、SA、及Western等多種手段對(duì)獲得的肝素酶單克隆抗體進(jìn)行特異性分析和效價(jià)鑒定,結(jié)果顯示所制備的3株單抗為人肝素酶特異的,且效價(jià)較高的單克隆抗體。
　　 結(jié)論
　　 1.我們采用PCR技術(shù)克隆了人肝素酶蛋白編碼基因。獲得了高純度的人肝素酶蛋白,獲得的肝素酶蛋白經(jīng)鑒定其測(cè)定分子量與理論分子量相符,可以用于肝素酶單克隆抗體的制備;
　　 2.成功制備了3株人肝素酶特異性的單克隆抗體,獲得的三株人肝素酶單克隆抗體經(jīng)E