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文檔簡介
1、CD分子在血細(xì)胞的分化、增殖、活化、遷移以及機體防御性免疫應(yīng)答、炎癥、凋亡、自身免疫和器官發(fā)生等許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。CD分子和CD mAb作為一種重要的手段和方法,已廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中,包括對基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)理論以及多種疾病的發(fā)病機制、診斷、預(yù)防和治療等臨床醫(yī)學(xué)的研究。 CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,也是T淋巴細(xì)胞重要的表面標(biāo)志物,它作為粘附分子、輔助受體和免疫調(diào)節(jié)物廣泛參與TCR對MHCI
2、分子遞呈抗原的識別和信號傳遞。CD8分子做為一類信號傳遞受體,其分子胞質(zhì)部分與非受體型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相連,參與TCR介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)。CD8分子包括CD8αα同型二聚體和CD8αβ異型二聚體,CD8同αα型二聚體分子在小鼠腸上皮下與非典型MHCⅠ類分子作用,構(gòu)成腸道免疫屏障。為了解膜蛋白分子在機體特異性免疫應(yīng)答中的作用及其機理,本研究進行了pCD8β基因的原核表達和單克隆抗體的制備。 根據(jù)本實驗測定的pC
3、D8β基因序列和原核表達載體pET-28a的多克隆酶切位點序列去掉信號肽設(shè)計一對引物,應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pGEM-T-pCD8β中擴增出編碼pCD8β蛋白的基因。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達載體pET-28a多克隆酶切位點,經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定和EcoRⅠ,HindⅢ雙酶切鑒定,篩選出陽性重組克隆,構(gòu)建成pCD8β基因的原核表達質(zhì)粒pET-28a-pCD8β。將這種原核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)0.5mmol/L IP
4、TG的誘導(dǎo)在28℃表達,SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到表達,表達產(chǎn)物是以包涵體的形式存在的重組蛋白pET-28a-pCD8β,且所獲得的重組蛋白分子量約為24Ku,與預(yù)期結(jié)果相符。 通過優(yōu)化原核表達條件,確定了重組質(zhì)粒pET-28a-pCD8β的原核表達最佳誘導(dǎo)時間、溫度和誘導(dǎo)劑濃度,并用優(yōu)化后的條件對含有pET-28a-pCD8β質(zhì)粒的BL21菌進行了大量誘導(dǎo)表達。使用反復(fù)凍融和超聲方法來裂解表達
5、菌,利用切膠法純化目的蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,經(jīng)過雜交瘤細(xì)胞的建立、融合細(xì)胞的篩選和克隆化培養(yǎng),成功獲得了一株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,經(jīng)ELISA檢測分析,用小鼠腹水制備的單克隆抗體的效價達1×106; Western-blotting分析證明,此單抗能特異性識別pCD8β蛋白分子,這為研究豬CD8細(xì)胞及其亞群的組織分布、種類和數(shù)量的動態(tài)變化以及細(xì)胞表面標(biāo)志的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。 本研究成功地表達pCD8β基
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