空腸彎曲菌flaA、peb1A基因的克隆表達(dá)及單克隆抗體的制備.pdf

1、空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C. jejuni)是近十幾年受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛重視的一種重要的人畜共患的病原菌。該菌除引起人發(fā)熱、急性腸炎、Reiter和Guillain-Barri綜合征等疾病外，還可引起牛和綿羊流產(chǎn)，火雞的肝炎和藍(lán)冠病，童子雞和雛雞壞死性肝炎，雛雞、犢牛、仔豬的腹瀉等多種疾病，已成為全球范圍內(nèi)急性胃腸炎最常見的病因之一。本試驗(yàn)對(duì)空腸彎曲菌分離鑒定和保存的條件進(jìn)行了優(yōu)化，針對(duì)C.jejuni可能

2、的毒力因子鞭毛蛋白(FLA)和外膜蛋白(PEB1)基因進(jìn)行了克隆測(cè)序、人工改造合成，高效地表達(dá)了FLA、PEB1，并利用表達(dá)的FLA蛋白篩選了針對(duì)空腸彎曲菌鞭毛的單抗；建立了flaA、peblA基因常規(guī)PCR和套式PCR檢測(cè)方法。 分5組對(duì)空腸彎曲菌的培養(yǎng)氣體條件，培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間、保存等條件進(jìn)行了優(yōu)化；參考GB、SN、FDA標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行人工布菌及分離鑒定，探討其分離靈敏度；對(duì)南京市場(chǎng)的雞肉、牛奶等食品的污染情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)

3、果顯示將空腸彎曲菌以分區(qū)劃線方式接種在Skirrow血平板，在5％O2、10％CO2和85％N2的混合氣體三氣培養(yǎng)箱中，37-42℃培養(yǎng)36-48h，生長(zhǎng)最佳；加脫脂乳凍干后置于-80℃有利于該菌的長(zhǎng)期保存；增菌前先分別將樣品進(jìn)行細(xì)菌富集處理，在增菌液中加入血、頭孢哌酮，用雙平板進(jìn)，行分離能有效地提高分離率，靈敏度可達(dá)到100CFU/mL或100CFU/g；南京市場(chǎng)部分樣品隨機(jī)抽取80份/種，其空腸彎曲菌的平均檢出率分別為：生鮮雞肉23

4、.75％，冷凍雞肉11.25％，牛奶16.50％，市場(chǎng)污水6.25％。 由于空腸彎曲菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)費(fèi)力，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，本試驗(yàn)針對(duì)空腸彎曲菌flaA、peblA基因的建立了常規(guī)PCR及套式PCR法對(duì)該菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明傳統(tǒng)檢測(cè)方法的靈敏度為45-100CFU/mL；常規(guī)PCR靈敏度10-20CFU/mL；套式PCR法靈敏度為2-6CFU/mL。所建立的套式PCR方法在靈敏度等指標(biāo)上均優(yōu)于空腸彎曲菌的傳統(tǒng)檢測(cè)和常規(guī)PCR

5、檢測(cè)方法。 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的空腸彎曲菌NCTC11168(Pen2血清型)的flaA、peblA基因序列，分別設(shè)計(jì)和合成2對(duì)引物，并以ATCC29428株的基因組為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出flaA、peblA基因片段，定向克隆至pMD18-T載體中并測(cè)序，利用DNAstar軟件，將所測(cè)序列與不同來(lái)源彎曲菌的flaA、peblA序列進(jìn)行同源性比較；結(jié)果表明所克隆的基因與報(bào)道的NCTC11168 flaA、peblA基因序列核苷酸

6、序列同源性分別為88.3％，98.1％。 測(cè)序可知flaA、peblA基因序列(G+C)％含量低，與E.coliBL21(DE3)的密碼子兼并性較差，用軟件改造合成了flaA(1-588bp)、peblA(72-780bp)的區(qū)間序列，構(gòu)建pET-28a(+)flaAg、pET-28a(+)-peblAg表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物，最高表達(dá)量占全菌總蛋白的70％左右；N

7、i2+-NTA親和層析法收集表達(dá)的目的重組蛋白FLA、PEB1，用空腸彎曲菌全菌小鼠抗體的Westernblot鑒定FLA、PEB1免疫原性，間接ELASA試驗(yàn)鑒定FLA、PEB1免疫小鼠的抗血清，效價(jià)分別為1:12800，1:25600，結(jié)果表明FLA、PEB1具有良好的免疫原性，為亞單位疫苗的研制和單克隆抗體的篩選奠定了基礎(chǔ)。 用0.8％甲醛滅活的空腸彎曲菌ATCC29428株全菌作為抗原，常規(guī)免疫Balb/c小鼠，待ELI