桔青霉素人工抗原合成鑒定和卵黃抗體制備及檢測方法研究.pdf

1、桔青霉素(Citrinin，CTN)是青霉屬和曲霉屬等某些真菌菌株產(chǎn)生的真菌毒素，分子式是C13H14O5，分子量為250，其化學(xué)命名為(3R，4S)—4，6-二氫—8-羥基—3，4，5-三甲基—6-氧—3H—2-苯吡—7羧酸。桔青霉素具有良好的抑菌性，能抑制芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、結(jié)核分枝桿菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌，還能抗某些真菌和原生動物，對革蘭氏陰性菌抑制弱。但是桔青霉素能引起許多動物的腎臟毒害，并有致癌性，

2、因為桔青霉素的這些特性，近年來桔青霉素污染引發(fā)的包括對人在內(nèi)的哺乳動物的毒害問題，越來越引起人們的關(guān)注。 桔青霉素的檢測方法有多種，目前測定桔青霉素的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法和免疫化學(xué)方法。其中免疫化學(xué)方法由于具有較高的靈敏度和特異性、對樣品的純度要求不高、特別適合于大批量樣本的檢測，近年來被廣泛應(yīng)用于各種真菌毒素的檢測。免疫化學(xué)方法必須以抗體為基礎(chǔ)，若要提高檢測方法的靈敏度和特異性，關(guān)鍵是要得到對桔青霉素具有高度特

3、異性和親和力的抗體。Abramson等報道，用多克隆抗體研制的ELISA試劑可用于檢測桔青霉素；2007年，劉仁榮制備桔青霉素的單克隆抗體，并建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法。 但是迄今為止，全世界仍未能制訂桔青霉素檢測的統(tǒng)一方法和標準，我國現(xiàn)在還沒有建立測定桔青霉素的標準方法。其主要原因是不同國家采取的方法和標準各不相同，缺乏行之有效的分析檢測方法。為了保護公眾健康，必須盡快建立更加靈敏、精確、方便操作的桔青霉素檢測分析方法

4、，并制定統(tǒng)一的檢測標準。因為卵黃抗體IgY的運用越來越廣泛，但是，到目前仍沒有利用卵黃抗體IgY建立檢測桔青霉素的相關(guān)方法，本研究通過制備桔青霉素人工抗原免疫萊亨雞，獲得桔青霉素卵黃抗體IgY，并建立ELISA分析方法和膠體金方法，進行方法學(xué)評價。 研究方法 第一部分，桔青霉素人工抗原的合成與鑒定。采用甲醛加成法，制備并獲得桔青霉素—小牛血清白蛋白(CTN—BSA)結(jié)合物，10000rpm離心15分鐘去除沉淀，然后—60

5、℃真空抽干，得到CTN—BSA產(chǎn)物；用同樣的方法，得到CTN與OVA偶聯(lián)物，即桔青霉素—卵清蛋白結(jié)合抗原CTN—OVA，最后進行真空抽干，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?用波長為240nm—400nm紫外光譜分析方法，對CTN，BSA，OVA，CTN—BSA和CTN—OVA同時進行掃描分析；并使用紅外線光譜法對以上物質(zhì)進行掃描分析；同時對合成抗原經(jīng)過SDS—PAGE電泳鑒定。 第二部分，制備和純化桔青霉素抗體IgY。使用人工合成

6、抗原CTN—BSA免疫產(chǎn)卵期白萊亨雞，第一次每只雞注射1.0ml乳化抗原加完全弗氏佐劑，然后進行4輪半量乳化抗原加不完全弗氏佐劑的加強免疫注射，收集免疫后產(chǎn)卵，同時留取免疫前產(chǎn)卵作為陰性對照。 采用優(yōu)化的Clarke方法進行桔青霉素卵黃抗體IgY純化，用3體積4％的聚乙二醇6000溶液和3體積氯仿，稀釋1體積卵黃，共進行兩次沉淀，獲得桔青霉素卵黃抗體IgY，然后在—60℃條件下進行真空抽干，產(chǎn)物置于—20℃保存?zhèn)溆谩?使

7、用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳方法(Sodiumdodecylsulfate—polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS—PAGE)，進行桔青霉素卵黃抗體IgY鑒定。 采用ELISA檢測法的方陣滴定，測定桔青霉素卵黃抗體IgY效價，用免疫前卵清蛋白作為陰性對照，確定檢測抗體的最大稀釋度。 桔青霉素抗體IgY穩(wěn)定性試驗：(1)IgY熱穩(wěn)定性試驗，將IgY用PBS稀釋成1mg/ml，分別在

8、20℃～80℃水浴內(nèi)處理20min，采用ELISA方法測定其吸光度值，檢測活性；另外分2組65℃水浴30分鐘、72℃15秒進行巴氏消毒，ELISA測定活性；(2)pH試驗，在pH值為1～12的條件下，37℃孵育2小時后ELISA測定活性；(3)胃蛋白酶試驗，將胃蛋白酶按1:3000進行稀釋，用pH4.0的0.05mol/LTris—C1緩沖液將IgY稀釋成1mg/ml，在100μlIgY稀釋液中分別加入10μl上述胃蛋白酶溶液，37℃分

9、別作用1～8小時后，ELISA測定活性；(4)胰蛋白酶試驗：將胰蛋白酶銨1:400稀釋，用PBS將桔青霉素IgY濃度稀釋至1mg/ml，調(diào)整反應(yīng)pH為8.0，37℃分別反應(yīng)1～4h，ELISA測定活性；(5)凍融處理：冰凍于—20℃，融化于4℃，反復(fù)凍融5次，ELISA測定活性。 桔青霉素抗體IgY的特異性檢測，采用ELISA試驗檢測桔青霉素，同時檢測OTA，AFB1，PAT，DON和ZON，檢測桔青霉素卵黃抗體IgY特異性。

10、 第三部分，檢測桔青霉素的間接競爭ELISA方法的建立和應(yīng)用評價。使用ELISA方陣滴定法，確定最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋度；同樣確定最佳酶標記二抗稀釋度；建立檢測桔青霉素的間接競爭ELISA的標準曲線，確定其檢測限和線性范圍，并且將間接競爭ELISA法和高效液相色譜法(HPLC)，進行檢測桔青霉素的相關(guān)性研究，相關(guān)系數(shù)為r=0.9896；然后進行樣品加標回收實驗、酶標板均一性檢測，平均吸光度值為A：1.357，變異系數(shù)(CV

11、)為：3.896％，評價間接競爭抑制ELISA檢測方法結(jié)果較好。 第四部分，建立膠體金標記抗體檢測桔青霉素方法以及初步應(yīng)用。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金；取制備好的膠體金溶液，用紫外分光光度計測定制備的膠體金的最大吸收峰值，用透射電鏡掃描測定制備的膠體會的形狀，以判斷膠體金制備效果；利用10％氯化鈉加入，并用分光光度計測其在580nm處的吸光度值，測得膠體金標記抗體的最小用量，然后計算出膠體金標記抗體最適穩(wěn)定量；利用波長580

12、nm條件下測定吸光度值，選定膠體金標記抗體時的最佳pH值；采用低溫超速離心法純化膠體金標記抗體，以除去其中未標記的抗體和未充分標記的膠體金以及在標記過程中可能形成的各種聚合物。 優(yōu)化試驗步驟，建立競爭法膠體金標記抗體檢測桔青霉素方法，鑒定其特性，包括確定其檢測限為20ng/ml，將膠體金標記抗體檢測桔青霉素方法與間接競爭ELISA法進行相關(guān)性比較；然后檢測試制膠體金檢測試紙條的性能。 主要研究結(jié)果 1、成功完成桔

13、青霉素人工抗原合成與鑒定 使用紫外光譜分析方法和紅外線光譜法，分別對CTN，BSA，OVA，CTN—BSA和CTN—OVA進行鑒定分析；由紫外線光譜鑒定圖和紅外線光譜鑒定圖；以及對合成抗原經(jīng)過SDS—PAGE電泳鑒定的實驗證明，采用甲醛加成法的人工免疫抗原CTN—BSA和檢測用包被抗原CTN—OVA成功合成。 2、通過免疫過程，制備和純化桔青霉素卵黃抗體IgY，并進行抗體鑒定和特異性檢測 用ELISA方法測定桔青

14、霉素卵黃抗體IgY的效價結(jié)果顯示，桔青霉素人工抗原免疫效果明顯，桔青霉素卵黃抗體IgY的最高效價為1:102400，表明免疫的CTN人工抗原免疫刺激白萊亨雞產(chǎn)生了針對CTN的較高的滴度特異性抗體。 桔青霉素抗體IgY的凝膠電泳(SDS—PAGE)鑒定結(jié)果顯示，通過制備得到最終較純的桔青霉素卵黃抗體IgY；桔青霉素IgY抗體特異性測試結(jié)果表明，當濃度達到10，000ng/ml時沒有出現(xiàn)與固定抗原表面決定簇產(chǎn)生競爭交叉反應(yīng)的其它毒素

15、(OTA，AFB1，PAT，DON和ZON)，證明獲得了特異性強的桔青霉素卵黃抗體IgY。 3、利用制備和純化桔青霉素卵黃抗體IgY，建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗定量檢測桔青霉素 使用ELISA方陣滴定法，用確定最佳包被抗原濃度和最佳抗體稀釋度，最佳包被抗原濃度為CTN—OVA10μg/ml，枯青霉素卵黃抗體IgY最大檢測靈敏度的效價為1:256，同樣方法確定最佳酶標記二抗稀釋度為1:500。 建立檢測桔青霉素的

16、間接競爭ELISA的標準曲線，確定其檢測限10ng/ml，和線性范圍為20～640ng/ml；間接競爭ELISA法和高效液相色譜法(HPLC)進行檢測桔青霉素的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)為r=0.9896；樣品加標回收實驗的平均的回收率為94.47％，平均變異系數(shù)為4.917％；酶標板均一性檢測的平均變異系數(shù)為3.896％。 4、利用免疫膠體金結(jié)合桔青霉素卵黃抗體IgY，建立膠體金檢測桔青霉素方法以及初步應(yīng)用 采用檸檬酸三鈉還

17、原法成功制備40nm左右膠體金；紫外分光光度計測定和透射電鏡掃描測定制備的膠體金的形狀，顯示膠體金制備效果較好；測得膠體會標記抗體最適穩(wěn)定量為45ug/ml；選定的膠體金標記抗體時的最佳pH值為8.5。 優(yōu)化試驗步驟，建立了競爭法膠體金標記抗體檢測桔青霉素方法，其檢測限20ng/ml，膠體會標記抗體檢測桔青霉素方法與間接競爭ELISA法的符合率為97.0％；膠體金檢測試紙條的性能檢測顯示試紙條保存期可大于6個月。 結(jié)論：