呋喃丹半抗原合成與多克隆抗體制備及其檢測應(yīng)用.pdf

1、呋喃丹(Carbofuran，2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)，學(xué)名克百威，自1969年由FMC公司和Mobay化學(xué)公司開發(fā)生產(chǎn)后即作為一種高效、廣譜的殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于糧食、蔬菜和水果等的害蟲防治。呋喃丹能與體內(nèi)的膽堿酯酶不可逆結(jié)合，從而抑制其活性，使乙酰膽堿在組織中蓄積而引起中毒。在土壤中殘留呋喃丹不易降解，半衰期較長，其降解產(chǎn)物3-羥基呋喃丹的毒性高于呋喃丹，易造成環(huán)境污染。國家農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)中已規(guī)

2、定其在糧食和蔬菜中不得檢出，但違禁使用現(xiàn)象仍較嚴(yán)重，給果蔬農(nóng)產(chǎn)品出口經(jīng)濟(jì)帶來嚴(yán)重?fù)p失。因此，建立快速、靈敏的檢測方法，對加強(qiáng)食品安全監(jiān)測，保護(hù)環(huán)境具有重要意義。本研究以呋喃丹、對硝基苯氯甲酸酯和6-氨基己酸為反應(yīng)原料，避免傳統(tǒng)的三光氣化學(xué)合成工藝，合成呋喃丹半抗原：6-[[(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH)。將半抗原與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)制備了呋喃丹人工免疫抗原BSA-BFNH和包被

3、抗原OVA-BFNH。利用BFNH-BSA免疫家兔獲得抗呋喃丹多克隆抗體，并通過間接ELISA法測定抗體效價(jià)。結(jié)果表明家兔抗血清效價(jià)達(dá)到1.28×106。根據(jù)方陣滴定篩選抗原抗體最佳工作濃度，當(dāng)OD450在1.0左右時(shí)，包被抗原濃度為0.25μg·ml-1，一抗稀釋倍數(shù)為1：1.6×105，羊抗兔IgG-HRP稀釋1：104倍，以此作為本實(shí)驗(yàn)的最佳工作濃度。采用正辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體，純化抗體效價(jià)達(dá)到1.024×107，濃縮后抗體

4、的蛋白濃度為40mg·mL-1，經(jīng)10％SDS-PAGE分析，重、輕鏈分子量分別約為55kDa和22kDa。通過間接競爭ELISA測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)呋喃丹抑制率，制作呋喃丹標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用軟件Origin7.5進(jìn)行線性回歸分析。在10-7～0.01mg·mL-1范圍內(nèi)，抑制率與標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥濃度的線性關(guān)系顯著，y=27.13+3.54X(R=0.9971)，最低檢測限為10-7mg·mL-1，與5種結(jié)構(gòu)相似的氨基甲酸酯類的交叉反應(yīng)率低于10％。