副溶血性弧菌及其外膜蛋白的多克隆抗體制備與應用.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,簡稱Vp)是一種廣泛分布于海洋與鹽湖中的致病性嗜鹽細菌,海產品(特別是貝類)中常有此菌,它是引起食源性疾病的主要病原之一,食用這種被染有副溶的生鮮或未煮熟的海產品可能會導致急性腸胃炎,其癥狀為腹瀉,頭痛,嘔吐,惡心以及腹部絞痛[1]。根據國家食源性疾病監(jiān)測網對我國13個地區(qū)食源性疾病爆發(fā)情況的監(jiān)測數據,自1992～2001年的十年間共上報食物中毒事件5770起,患者人數達16

2、2995人,其中由微生物引起的食源性疾病事件和涉及人數最多,分別占總體的38.5％和50.9％。在細菌性食物中毒的構成中,又以副溶血性弧菌引起的急性腸胃炎占首位[3]。而根據1998年以來的數據,副溶血性弧菌食物中毒已在數量上超過沙門氏菌中毒案例,成為我國的首要食源性致病菌,特別是在一些沿海城市,由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒總數的比例高達60％以上[5—8]。
　　 本文通過小鼠毒力試驗比較了5株副溶血性弧菌菌株的致病性

3、；比較不同因子對制備副溶血性弧菌的外膜蛋白的效果,利用SDS—PAGE觀察比較不同菌株外膜蛋白的電泳圖譜,確定致病性副溶可能有的共同的保護性抗原。進一步制備出副溶血弧菌菌體及多克隆抗體,通過辛酸硫酸銨兩步法純化抗體,ELISA測定抗體效價,Westernblot檢測血清識別的主要蛋白帶。將所獲得的菌體血清和外膜蛋白對小鼠進行主動保護性試驗和被動保護性試驗,比較其效果。
　　 本課題主要圍繞以下幾方面開展了一些研究:
　　

4、 1副溶血弧菌致病性的研究
　　 將5株Vp菌株接種于TSA+3％NaCl斜面,28℃培養(yǎng)24h,用無菌PBS液(pH7.2—7.4)洗脫至TCBS平板中,培養(yǎng)24h后PBS洗脫制成菌懸液,調整菌液濃度為l×109個/ml,然后腹腔注射小白鼠,劑量為0.4ml/只,對照組注射無菌PBS液.注射后消毒小白鼠體表,置于鼠籠中喂養(yǎng).逐日觀察,記錄發(fā)病及死亡情況.結果表明不同副溶血性弧菌菌株對于小鼠的致病性不同,死亡率最高可達83.3％

5、.將試驗菌接種到血液瓊脂平板培養(yǎng)基上,經過28℃培養(yǎng)18—24h后,5株副溶菌株均能在我萋血平板上形成溶血圈,表明其含有TDH基因,具有明顯的致病性.
　　 2副溶血弧菌菌體多克隆抗體的制備及純化
　　 受免動物血清抗體效價是評價特異性免疫效果的一個主要指標,抗體效價的高低通常顯示了免疫的成敗.利用0.05％(V/V)甲醛、30℃將標準菌株V.p1.2164滅活4h,制備免疫抗原,對新西蘭大白兔進行耳靜脈注射后,采血吸取

6、上層血清并離心去除紅細胞,辛酸硫酸銨二步法純化所得抗體[9]:采用間接ELISA法測定效價為1.6×105,且與其他菌株均無交叉反應,能夠滿足免疫試驗的需要.間接ELISA最佳參數為:60℃烘干包被,抗原包被濃度為107 cfu/mL；封閉時間2.5h；一抗工作稀釋度為1:4000；抗原、一抗孵育時間為75min；酶標二抗工作稀釋度為1:1000；一抗與酶標二抗孵育時間為60min；酶與底物反應溫度為30℃,時間為15min；孵育溫度為

7、37℃.
　　 3副溶血弧菌外膜蛋白的提取及免疫鑒定
　　 將副溶菌株接種在3種不同培養(yǎng)基平板上,利用PMSF法提取外膜蛋白.結果表明,在TSA+3％NaCl中的表達的蛋白含量略高于其他三種培養(yǎng)基,在培養(yǎng)4h后即開始有OMP出現,到24h后到達高峰,此后逐漸呈下降趨勢.在不同溫度下培養(yǎng)Vp時發(fā)現在28℃表達的外膜蛋白含量更高,且主要蛋白帶更明顯.5株具有明顯致病性的Vp在外膜蛋白SDS電泳圖譜上十分相似,主要有9—15條

8、蛋白帶,主要集中在66kD和20kD之間,其中5條主要蛋白帶為所有菌株所共有,其大致分子量為:85kD,50kD,40kD,33kD,24kD.不同菌株主要蛋白質的數量和含量有所不同.Westernblot表明純化后的血清與所有菌株均有兩條明顯的免疫反應帶,其大致分子量約為33kD和40kD.這兩條外膜蛋白有可能是致病性副溶血弧菌的主要保護性抗原,具備作為疫苗的候選材料的可能性.
　　 4主動保護性和被動保護性試驗