不同環(huán)境樣品中副溶血性弧菌毒力基因表達(dá)差異研究及副溶血性弧菌活菌定量方法的建立.pdf

1、副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性海洋細(xì)菌,是導(dǎo)致海產(chǎn)品性腸胃炎的主要病原菌。該菌廣泛分布于全世界范圍內(nèi)的河口、海洋及近海環(huán)境中。近年來(lái)副溶血性弧菌的感染病例呈上升趨勢(shì),給水產(chǎn)品養(yǎng)殖和海產(chǎn)品消費(fèi)帶來(lái)極大的安全隱患。研究表明,副溶血性弧菌主要致病因子是溶血素類,它們是耐熱直接溶血素(TDH)、耐熱相關(guān)溶血素(TRH)以及不耐熱溶血素(TLH)。另外,海蝦中的副溶血弧菌檢出率高達(dá)90％,嚴(yán)重威脅人體健康及水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)者。
　　基因表達(dá)分析在

2、生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中變得日趨重要,而隨之產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)已成為了以高通量和準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量為特點(diǎn)的基因表達(dá)分析的首選方法,可用于常規(guī)的病原微生物檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性分析以及基因表達(dá)分析。目前,針對(duì)副溶血性弧菌毒力基因表達(dá)已經(jīng)開展了初步的研究,但這些研究主要都是基于副溶血性弧菌的實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件以及單一的物理化學(xué)因素影響下的基因表達(dá)變化,存在一定的局限性。相關(guān)弧菌基因表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn),病原菌生存的真實(shí)環(huán)境對(duì)

3、于研究其基因表達(dá)情況是十分重要的,在研究其毒力因子表達(dá)情況時(shí),應(yīng)盡量接近其生存的真實(shí)環(huán)境。另外選用表達(dá)穩(wěn)定的基因作為校正內(nèi)參對(duì)于完整的基因表達(dá)評(píng)價(jià)體系的建立是十分必要的。國(guó)內(nèi)外針對(duì)內(nèi)參基因的篩選已經(jīng)有了大量的報(bào)道,但是多局限于植物和動(dòng)物,而在致病微生物毒力基因表達(dá)方面的相關(guān)研究中對(duì)內(nèi)參基因篩選的關(guān)注較少。因此,本研究從副溶血性弧菌廣泛分布的水體環(huán)境出發(fā),以蝦樣品中、海水樣品中、過(guò)濾海水樣品以及純培養(yǎng)條件下的副溶血性弧菌為研究材料,先針對(duì)

4、實(shí)驗(yàn)材料以及處理?xiàng)l件的不同篩選出表達(dá)穩(wěn)定的管家基因作為表達(dá)分析的內(nèi)參基因。后續(xù)采用qRT-PCR技術(shù),對(duì)不同菌株以及不同環(huán)境條件處理后副溶血性弧菌tdh、trh和tlh基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析,希望為進(jìn)一步揭示環(huán)境因子對(duì)毒力基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制及其不同毒力基因的環(huán)境適應(yīng)性的相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。
　　近年來(lái),隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,已建立起許多基于熒光定量PCR的海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測(cè)方法,這些方法憑借其特異性好,靈敏度高且

5、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)已得到了較廣泛的應(yīng)用。目前這些熒光定量PCR的檢測(cè)技術(shù)大多基于DNA樣品,但由于無(wú)法從DNA水平區(qū)分出檢測(cè)樣品中的死細(xì)胞、活細(xì)胞以及不可培養(yǎng)細(xì)胞,這樣會(huì)使我們過(guò)高或錯(cuò)誤的估計(jì)樣品所存在的風(fēng)險(xiǎn)。隨之產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù),采用mRNA模板來(lái)取代DNA模板,可很大程度上降低活菌檢測(cè)中的假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)的概率,得到更準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)結(jié)果。所以,本研究建立了一種基于RNA技術(shù)的副溶血性弧菌的活菌檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)

6、果表明:
　　1、目前針對(duì)于食品樣品中微生物總RNA的提取尚無(wú)一個(gè)成熟的方法,是后續(xù)相關(guān)分析的一大難點(diǎn)。因此我們首先對(duì)蝦樣品中副溶血性弧菌總RNA提取條件進(jìn)行了優(yōu)化,設(shè)置了兩種細(xì)胞恢復(fù)溶液:0.85%生理鹽水和0.1%蛋白胨溶液,以及兩種均質(zhì)方法,均質(zhì)器勻漿和晃動(dòng)均質(zhì),恢復(fù)溶液和均質(zhì)方法亮亮組合進(jìn)行提取效果的對(duì)比。結(jié)果顯示晃動(dòng)均質(zhì)以及0.85%生理鹽水組合提取的方法,能夠從蝦樣品中提取得到較高純度和完整性的副溶血性弧菌總RNA,可

7、供后續(xù)基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)使用。
　　2、采用geNorm軟件計(jì)算并分析了相關(guān)文獻(xiàn)中已發(fā)表的4種副溶血性弧菌管家基因的表達(dá)穩(wěn)定性,表達(dá)穩(wěn)定性排列順序?yàn)閜vuA>pvsA>GAPDH>rpoS,再經(jīng)過(guò)最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)目評(píng)價(jià),確定了以pvuA和pvsA兩個(gè)基因的幾何平均值作為參照可更為準(zhǔn)確地校正目的基因的表達(dá)。結(jié)果證明pvuA和pvsA基因可作為環(huán)境樣品中副溶血性弧菌毒力基因表達(dá)變化研究的內(nèi)參基因。
　　3、采用qRT-PCR方法對(duì)5

8、株菌在不同溫度的海水、過(guò)濾海水及蝦樣品中毒力基因的表達(dá)變化情況進(jìn)行了分析,結(jié)果初步顯示來(lái)源于不同菌株的毒力基因?qū)Νh(huán)境條件的適應(yīng)能力存在差異。不同菌株的trh及tlh基因顯示出了一定的低溫高表達(dá)的特點(diǎn);其次tdh基因表達(dá)的溫度依賴性不顯著,但QD菌株的tdh基因顯示出了較高的饑餓耐受能力;另外攜帶有tdh及trh毒力基因菌株的tlh基因表達(dá)量與僅攜帶tlh基因菌株的tlh基因表達(dá)量之間存在較大的差異,由此推測(cè)tdh及trh基因的存在對(duì)tl

9、h基因的表達(dá)量有一定的影響。
　　4、本研究首次建立了一種基于RNA技術(shù)的蝦中副溶血性弧菌的活菌定量方法。該方法免去了傳統(tǒng)分離定量方法的增菌和培養(yǎng)過(guò)程,可在5小時(shí)之內(nèi)完成整個(gè)實(shí)驗(yàn),而且彌補(bǔ)了DNA定量方法的不足,排除了死細(xì)胞的干擾,能夠準(zhǔn)確對(duì)蝦樣品中活的副溶血性弧菌進(jìn)行定量,反映出樣品的真實(shí)致病風(fēng)險(xiǎn)。設(shè)計(jì)得到的tlh基因的引物特異性較高,RNA標(biāo)準(zhǔn)品以及標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,方法檢測(cè)限可達(dá)到58cfu/g樣品,可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)