海產(chǎn)品中副溶血性弧菌快速檢測研究及應用.pdf

1、目的：
　　建立一種特異、靈敏的快速檢測海產(chǎn)品中副溶血性弧菌及其毒力基因的方法，并用于海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的快速檢測。
　　方法：
　　1.直接分離檢測法:制備副溶血性弧菌ATCC338471×100～1×106cfu/ml菌液，取各濃度菌液1ml直接用TCBS平板進行劃線分離，每一濃度平行三份。對疑似菌落純培養(yǎng)后進行生化鑒定和毒力試驗。記錄實驗時間。
　　2.國標(GBT4789.7-2008)檢測法:制備副溶

2、血性弧菌ATCC338471×100～1×107cfu/ml濃度菌液，37℃增菌8h后，取各濃度增菌液1ml用TCBS平板進行劃線分離，平行三份。對疑似菌落純培養(yǎng)后進行生化鑒定和毒力實驗。記錄實驗時間。
　　3.直接PCR檢測法:制備副溶血性弧菌ATCC338471×100～1×106cfu/ml濃度菌液，取1ml菌液，提取基因組DNA，用特異性引物進行PCR，檢測副溶血性弧菌種特異性基因tlh和毒力基因tdh。記錄實驗時間。

3、r>　　4.快速檢測法:振蕩培養(yǎng)增菌結合PCR法。取副溶血性弧菌ATCC338471×100～1×106cfu/ml菌液1ml，加入到200ml堿性蛋白胨水中，37℃150rpm振蕩培養(yǎng)3h。分別取1ml增菌液提取細菌基因組DNA，PCR檢測種特異性基因tlh和毒力基因trh、tdh。
　　5.快速檢測法檢測模擬樣本中副溶血性弧菌:制備副溶血性弧菌ATCC33847污染牡蠣的模擬樣本，形成2.5×105、2.5×104、2.5×1

4、03、2.5×102、2.5×101、2.5×100、2.5×10-1cfu/ml濃度梯度帶菌量，37℃150rpm振蕩培養(yǎng)3h后，取1ml菌液，提取基因組DNA，用特異性引物進行PCR，檢測副溶血性弧菌種特異性基因tlh和毒力基因tdh。記錄實驗時間。
　　6.快速檢測法檢測市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌:購買溫州市售海產(chǎn)品160份，用快速檢測法檢測副溶血性弧菌。同時用國標法、直接PCR法檢測。
　　結果：
　　1.直接分

5、離檢測法:檢測副溶血性弧菌ATCC33847，檢測下限為1×104cfu/ml。實驗需24h，生化鑒定及毒力實驗需48h。
　　2.國標法(GBT4789.7-2008):檢測副溶血性弧菌ATCC33847，檢測下限為1×103cfu/ml。實驗需36h，生化鑒定及毒力實驗需48h。
　　3.直接PCR法:檢測副溶血性弧菌ATCC33847 tlh和tdh基因，檢測下限為1×102cfu/ml。實驗需3～4h。
　　4

6、.快速檢測法:檢測副溶血性弧菌33847 tlh和tdh基因，檢測下限為1×100cfu/ml。實驗需8h。
　　5.快速檢測法檢測模擬樣本:檢測下限為2.5×100cfu/ml。實驗需8h。
　　6.快速檢測法檢測市售海產(chǎn)品中VP:快速檢測法檢測溫州市售160份海產(chǎn)品，檢出VP陽性110份，檢出率68.8％;110份標本檢出攜帶VP毒力基因35份(31.8％)，其中trh+23份，tdh+12份。國標法VP檢出率40.0％