人ZHX2多克隆抗體的制備與應用.pdf

1、山東大學碩士學位論文人ZHX2多克隆抗體的制備與應用姓名：史偉申請學位級別：碩士專業(yè)：醫(yī)學免疫學指導教師：馬春紅20090518山東大學碩士學位論文采血法采血，利用飽和硫酸銨法對兔血清中的免疫球蛋白進行粗提，分裝后80℃保存，兩種ZHX2GST融合蛋白免疫后血清分別標記為ZHX2(1837AA)pAb和ZHX2(263—497AA)pAb。3抗體特異性檢測利用本實驗室構建的ZHX2真核表達載體pcDNA3ZHX2HA及空載體pcDNA3

2、分別轉染HepG2。48h后收集細胞，并分別利用上述制備的兩種多克隆抗體和商品化HA抗體(1：2000稀釋)，進行westernblot實驗，檢測轉染后HepG2細胞內(nèi)相應蛋白的表達。多克隆抗體按照1：100，1：500，1：1000，1：2000，l：4000比例稀釋，用于驗證該抗體對抗原識別的特異性，并確定抗體最適滴度。4抗體應用收集肝癌切除術術后組織標本和不同腫瘤細胞系細胞，SDS裂解液提取組織蛋白及細胞蛋白，利用自行制備的ZHX

3、2多克隆抗體進行Westernblot，檢測ZHX2在肝癌組織及不同腫瘤細胞系中的表達水平。爭士里：口木1ZHX2融合蛋白在原核細胞中的表達11重組質(zhì)粒pGEXZHX2(1_837從)、pGEXZHX2(263—497從)的鑒定重組質(zhì)粒CaCl2法轉化大腸桿菌BL21(DE3)，抽提陽性重組子質(zhì)粒DNA，經(jīng)BamHI和NotI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可見分子量約為2500bp與700bp左右的特異性條帶，與預期結果一致。D

4、NA測序分析及BLAST對比分析證明，重組載體插入序列正確，pGEXZHX2(1837AA)、pGEXZHX2(263497AA)內(nèi)分別含有編碼ZHX21837位氨基酸及263497位氨基酸的相應編碼序列。126STZHX2(卜837從)、GSTZHX2(263—497從)融合蛋白在原核細胞中的表達工程菌經(jīng)IPTG誘導6h后，分別收集菌體及上清，進行SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍染色顯示：IPTG誘導的陽性工程菌菌體蛋白電泳后在118K