牛白細(xì)胞介素2基因克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、牛白細(xì)胞介素2主要是由輔助性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種淋巴因子，通過免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)體免疫功能，在機(jī)體免疫反應(yīng)中起著極為重要的作用。因其具有免疫增強(qiáng)劑、抗腫瘤和抗感染的特點(diǎn)是理想的免疫佐劑和免疫治療劑。但正常情況下，機(jī)體產(chǎn)生的BoIL-2的量非常有限，一定程度上限制了對(duì)BoIL-2的研究和應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用重組DNA和基因表達(dá)技術(shù)，通過RT-PCR方法克隆BoIL-2基因，并對(duì)其基因序列進(jìn)行分析和表達(dá)，旨在為大量制備和生產(chǎn)高效價(jià)廉的BoIL-

2、2，為其生物學(xué)活性及應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 根據(jù)Genbank發(fā)表的BoIL-2基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物。以ConA刺激的外周血淋巴細(xì)胞(PMN)為材料，提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR的方法，擴(kuò)增BoIL-2基因序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段約為477bp。測序結(jié)果顯示，克隆的BoIL-2基因與Genbank發(fā)表的BoIL-2基因序列同源性為98.7％，氨基酸同源性為99.4％。 將測序正確的pMD-18-T-IL-2重組

3、質(zhì)粒及pET30a(+)載體，用EcoRI及SalI進(jìn)行雙酶切，分別回收后T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化、提取重組質(zhì)粒。通過雙酶切及PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測定后在大腸桿菌的表達(dá)，分子量約為23.49ku;表達(dá)產(chǎn)物主要分布在包涵體中。WesternBlot證實(shí)所得到的重組蛋白為BoIL-2重組蛋白。通過MTT法測定BoIL-2重組蛋白的活性，可知重組BoIL-2(rBoIL-2)對(duì)牛及山羊淋巴細(xì)胞有明顯作用，對(duì)豬淋巴細(xì)胞作用不明顯。用