HLA新等位基因的確認(rèn)、序列分析及其噬菌體展示單克隆抗體的制備.pdf

1、人類主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)位于人類第6對(duì)染色體短臂6P21.31-21.33，由一組緊密聯(lián)鎖的復(fù)等位基因位點(diǎn)組成。其全長3.6Mb～4Mb，約占整個(gè)人類基因組3×109bp DNA的0.13％左右。該復(fù)合體編碼人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)，包含蛋白編碼基因位點(diǎn)超過150余個(gè)，約占整個(gè)人類基因組已知約3.2萬個(gè)表達(dá)基因的0

2、.5％左右。
　　MHC是迄今所知人類最復(fù)雜、最具多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng)，也是人類基因組中已知基因最密集的區(qū)域。在人類基因組計(jì)劃(the Human Genome Project，HGP)開始之前，HLA基因復(fù)合體即是整個(gè)人類基因組中研究最充分的片段。作為人類基因組計(jì)劃的重點(diǎn)，MHC成為1999年人類基因組計(jì)劃中第一個(gè)完成全長測(cè)序的基因區(qū)域。其后，MHC區(qū)域基因數(shù)據(jù)不斷獲得更新。根據(jù)2009年Shiina等進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)，在總共3.78

3、Mb的MHC區(qū)域內(nèi)，已確認(rèn)基因位點(diǎn)更新為253個(gè)。包括HLA基因45個(gè)，非HLA基因208個(gè)。
　　MHC作為人類已知最復(fù)雜、最具多態(tài)性的基因區(qū)域，具有高度多態(tài)性。這種多態(tài)性表現(xiàn)為其主要基因位點(diǎn)含有大量的復(fù)等位基因，且等位基因的分布具有明顯的種族和地區(qū)差異，不同地區(qū)、不同人群中各等位基因的頻率各不相同。截止2017年，國際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(IMGT/HLA)已公布HLA等位基因16，755個(gè)[12]。其中HLA-Ⅰ類等位基

4、因12351個(gè)，包括HLA-A等位基因3913個(gè)，HLA-B等位基因4765個(gè)，HLA-C等位基因3510個(gè)。HLA-Ⅱ類等位基因4404個(gè)，包括HLA-D RB1等位基因2058個(gè)。HLA的這種高度多態(tài)性顯示了遺傳背景的多態(tài)性和復(fù)雜性。它是人類在進(jìn)化過程中抵御不良環(huán)境因素的一種適應(yīng)性表現(xiàn)，使人類具有更大的抵抗入侵病原體的能力，對(duì)維持種群的生存與延續(xù)具有重要的生物學(xué)意義。
　　近二十年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)與HLA DNA測(cè)序分型

5、技術(shù)應(yīng)用的不斷發(fā)展與成熟，HLA新等位基因的發(fā)現(xiàn)進(jìn)入快速發(fā)展期。隨著中華骨髓庫(CMDA)的建立與HLA分型數(shù)據(jù)的增加以及SBT(Sequencing Based Typing)測(cè)序分型技術(shù)的建立，在中國人群中不斷發(fā)現(xiàn)新HLA等位基因。
　　HLA抗體作為HLA應(yīng)用研究的重要組成部分，對(duì)于HLA臨床表型分析及移植排斥監(jiān)測(cè)具有重要意義。HLA抗體早期來源主要為妊娠、輸血等同種免疫。雜交瘤單克隆抗體技術(shù)建立后，其成為制備HLA抗體的主

6、要來源。
　　噬菌體抗體庫(phage antibody library)技術(shù)又稱噬菌體展示抗體文庫(phage-display antibody library)技術(shù)，是繼雜交瘤單克隆抗體技術(shù)之后，免疫抗體制備技術(shù)發(fā)展史上的又一重要技術(shù)飛躍。噬菌體抗體庫技術(shù)是由噬菌體展示技術(shù)發(fā)展而來，是噬菌體展示技術(shù)和抗體庫技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展出的一項(xiàng)新型抗體制備技術(shù)。
　　噬菌體抗體庫技術(shù)從根本上改變了傳統(tǒng)雜交瘤單克隆抗體的制備流程，繞過了

7、雜交瘤細(xì)胞融合和選擇性克隆化等流程，大大縮短了制備周期，增殖周期從數(shù)月可縮短至數(shù)周，極大地提高了制備效率;其抗體庫容量可擴(kuò)大達(dá)到106～109個(gè)克隆;并可直接獲得抗體的基因序列，并可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步基因工程改造。在HLA單克隆抗體應(yīng)用研究領(lǐng)域，噬菌體展示抗體技術(shù)研究尚未見報(bào)道。
　　我們自2008年起至今已發(fā)現(xiàn)確認(rèn)HLA新等位基因33例，均獲得WHO HLA因子命名委員會(huì)的正式命名。在論文第一部分，進(jìn)行了6個(gè)新等位基因的鑒定，并對(duì)其

8、變異序列的可能來源進(jìn)行分析，對(duì)其編碼蛋白空間分子結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行初步分析。
　　在論文第二部分，利用原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)4例A*24新等位基因:HLA-A*24∶191、A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257、A*24∶02∶01（作為標(biāo)準(zhǔn)A*24等位基因）以及A*24總變異序列（包含A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257這3個(gè)新等位基因的變異序列）編碼分子的重鏈胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行原核表達(dá)，然后通過噬菌體展示抗體

9、庫技術(shù)，針對(duì)HLA-A*24∶191新等位基因編碼的氨基酸變異位點(diǎn)，進(jìn)行單克隆抗體制備，作為今后對(duì)這些新等位基因的分子結(jié)構(gòu)和表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步的分析和了解的研究工具。
　　第一部分HLA新等位基因的發(fā)現(xiàn)鑒定及序列分析
　　目的：
　　發(fā)現(xiàn)、鑒定分析新的HLA等位基因序列
　　方法：
　　1.基因分型:樣本HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)常規(guī)高分辨分型采用HLA PCR-SBT(sequence-based typi

10、ng)測(cè)序分型與基于Luminex液相流式平臺(tái)的熒光微珠PCR-rSSO（reverse sequence-specific oligonucleotide probe，序列特異性寡核苷酸探針反向雜交）分型方法相結(jié)合的方法進(jìn)行。
　　2.基因序列分析:HLA常規(guī)高分辨分型異常樣本采用單等位基因特異性單鏈雙向測(cè)序技術(shù)，使用HLAssureTM SE SBT HLA Typing Kit測(cè)序試劑，對(duì)每個(gè)位點(diǎn)上的兩條單倍體上的雜合等位基

11、因，分開進(jìn)行單獨(dú)正反雙向測(cè)序。
　　3.新等位基因編碼蛋白分子空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析:使用SWISS-MODEL同源建模、Phyre2及RasMol和RCSB PDB Protein Workshop軟件，對(duì)新等位基因編碼蛋白分子空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬分析。
　　結(jié)果:
　　1.00333號(hào)樣本采用Luminex液相流式平臺(tái)rSSO熒光磁珠反向雜交分型復(fù)核，結(jié)果顯示為A*02∶06∶01+A*68∶01∶02，但伴有FP＃022、

12、FN＃072假反應(yīng)探針的異常結(jié)果。
　　該樣本SBT測(cè)序復(fù)核結(jié)果顯示A位點(diǎn)序列最匹配結(jié)果為A*02∶03∶01+A*68∶01∶02，但存在2個(gè)堿基差異，即在第2外顯子第98位核苷酸為A(A+A)而非W(A+T)，第102位核苷酸為Y(C+T)而非W(A+T)。
　　單等位基因雙向測(cè)序鑒定，表明該樣本A*02∶03∶01等位基因第2外顯子第98位核苷酸發(fā)生T-＞A堿基替代，導(dǎo)致第9位密碼子由TTC變?yōu)門AC，其編碼氨基酸由苯

13、丙氨酸(Phe，F(xiàn))變?yōu)槔野彼?Tyr，Y);第102位核苷酸發(fā)生A-＞C堿基替代，導(dǎo)致相應(yīng)的第10位密碼子由ACA變?yōu)锳CC，但其編碼氨基酸未發(fā)生改變。
　　2.01513樣本采用rSSO熒光磁珠流式反向雜交分型,結(jié)果顯示為罕見型DRB1*15∶66+DRB1*14∶05∶01/02，并存在FP＃516/517假陽性探針的異常結(jié)果。
　　SBT測(cè)序分型復(fù)核結(jié)果顯示DRB1位點(diǎn)最匹配結(jié)果為DRB1*14∶05∶01+DRB1

14、*15∶66，但存在2個(gè)堿基差異，即在第2外顯子第258位核苷酸為T(T+T)而非Y(T+C)，第261位核苷酸為Y(C+T)而非T（T+T），存在2個(gè)堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測(cè)序鑒定，表明該樣本DRB1*15∶66等位基因第2外顯子第258位核苷酸堿基發(fā)生C-＞T堿基替代，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)的第57位密碼子GAC→GAT;第261位核苷酸發(fā)生T-＞C堿基替代，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)的第58位密碼子GCT→GCC。但這兩個(gè)密碼子的堿基改

15、變都未造成編碼氨基酸改變。
　　3.00791號(hào)樣本SBT測(cè)序分型結(jié)果顯示A*24∶02∶01序列第2外顯子第215位核苷酸為R(A+G)而非G(G+G)，存在1個(gè)堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測(cè)序鑒定，表明該樣本第2外顯子第215位核苷酸堿基發(fā)生G-＞A堿基替代，導(dǎo)致相應(yīng)的第48位密碼子發(fā)生CGG→CAG，其編碼氨基酸由精氨酸（Arg，R）→谷氨酰胺(Gln，Q)。
　　4.00059樣本SBT測(cè)序分型結(jié)果顯示A

16、位點(diǎn)序列最匹配結(jié)果為A*24∶02∶01+A*33∶03∶01，但在第2外顯子第178位核苷酸為Y(C+T)而非T(T+T)，存在1個(gè)堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測(cè)序鑒定，表明該樣本A*24∶02∶01等位基因第2外顯子第178位核苷酸堿基發(fā)生T＞C堿基替代，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)的第36位密碼子發(fā)生TTC→CTC改變，其編碼氨基酸由苯丙氨酸(Phe,F)變?yōu)榱涟彼?Leu,L)。
　　5.00290樣本SBT測(cè)序分型結(jié)果顯示A

17、位點(diǎn)序列最匹配結(jié)果為A*24∶198+A*33∶03∶01，但第2外顯子第155位核苷酸為W(A+T)而非T(T+T)，存在1個(gè)堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測(cè)序鑒定，表明該樣本A*24∶198等位基因上第2外顯子第155位核苷酸堿基發(fā)生了T-＞A堿基替代，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)的第28位密碼子由GTG→GAG，其編碼氨基酸由纈氨酸(Val，V)變?yōu)楣劝彼?Glu，E)。
　　6.00550樣本Luminex液相流式平臺(tái)rSSO熒

18、光磁珠反向雜交分型，結(jié)果顯示為罕見型A*24∶02∶15+A*02∶01∶01，并存在FP＃043假陽性探針的異常結(jié)果。
　　SBT測(cè)序分型復(fù)核顯示A位點(diǎn)序列最匹配結(jié)果為A*24∶156+A*02∶01∶01，但第2外顯子第256位核苷酸為S(C+G)而非G(G+G)，存在1個(gè)堿基差異替代。
　　單等位基因雙向測(cè)序鑒定，表明該樣本A*24∶156等位基因上第2外顯子第256位核苷酸堿基發(fā)生了G-＞C堿基替代，結(jié)果導(dǎo)致相應(yīng)的第

19、62位密碼子由GAG→CAG，其編碼氨基酸由谷氨酸(Glu，E)變?yōu)楣劝滨０?Gln,Q)。
　　以上等位基因序列經(jīng)IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫BLAST檢索確認(rèn)后，遞交美國NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫，獲得注冊(cè)序列號(hào)，然后經(jīng)EMBL-EBI申報(bào)，分別被世界衛(wèi)生組織(WHO)HLA因子命名委員會(huì)正式命名為HLA-A*02∶355（00333樣本）、DRB1*15∶06∶02（01513樣本）、A*24∶224（00791樣本）、A*24

20、∶225（00059號(hào)樣本）、A*24∶257（00290樣本）和A*24∶191（00550號(hào)樣本）。
　　結(jié)論
　　發(fā)現(xiàn)鑒定6例HLA新等位基因，分別被WHO HLA命名委員會(huì)命名為HLA-A*02∶355（00333樣本）、HLA-DRB1*15∶06∶02（01513樣本）、HLA-A*24∶224(00791樣本)、HLA-A*24∶225（00059號(hào)樣本）、HLA-A*24∶257（00290樣本）和HLA-A

21、*24∶191（00550號(hào)樣本）。
　　第二部分通過噬菌體展示技術(shù)制備新等位基因A*24∶191編碼蛋白單克隆抗體
　　第一章A*24蛋白分子重鏈胞外結(jié)構(gòu)域的原核蛋白表達(dá)純化
　　目的:對(duì)A*24新等位基因重鏈胞外結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表達(dá)純化，制備原核表達(dá)可溶性蛋白。
　　方法:
　　1.以A*24∶19、A*24∶224、A*24∶225、A*24∶257新等位基因序列作為模板序列進(jìn)行蛋白表達(dá)。根據(jù)新等位基因A*

22、24∶224、A*24∶225、A*24∶257核苷酸序列變異位置，設(shè)計(jì)將以上3個(gè)新等位基因核苷酸變異匯總為A*24總變異序列（A*24Total Mutation），將A*24∶02∶01作為A*24標(biāo)準(zhǔn)蛋白序列。
　　2.基因模板采用重疊延伸PCR法，制備模板基因。使用NcoⅠ、XhoⅠ酶切pET-28a(+)載體。載體連接使用同源重組無縫克隆技術(shù)，將目的基因連接入載體進(jìn)行表達(dá)。
　　3.轉(zhuǎn)化使用TOP10感受態(tài)細(xì)胞，將

23、載體轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞。并進(jìn)行克隆鑒定。
　　4.目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)采用Transetta DE3細(xì)胞作為表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)目的蛋白進(jìn)行表達(dá)。
　　5.通過超聲裂解包涵體，使用Ni-NTA Resin柱純化法進(jìn)行可溶性蛋白純化。
　　6.SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)蛋白質(zhì)量。
　　結(jié)果:
　　1.模板重疊延伸PCR鑒定、菌液PCR鑒定結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物大小正確，符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.陽性克隆測(cè)

24、序結(jié)果顯示插入基因片段與目的基因序列一致無誤。
　　3.SDS-PAGE電泳及Western Blot結(jié)果顯示表達(dá)蛋白大小正確，該表達(dá)可溶性蛋白可用于下一步單克隆抗體鑒定。
　　第二章 HLA-A*24∶191編碼蛋白噬菌體展示庫單克隆抗體制備
　　目的:
　　通過噬菌體展示技術(shù)制備A*24新等位基因單克隆抗體
　　方法:
　　1.使用A*24∶191變異序列合成多肽免疫5只小鼠，共計(jì)4次，其間隔時(shí)間

25、為分別為3/2/2周。免疫完成7天后ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)。3天后進(jìn)行免疫終加強(qiáng)。
　　2.終加強(qiáng)免疫完成第2天提取小鼠脾臟RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。
　　3.使用25對(duì)輕鏈基因引物及50對(duì)重鏈基因引物，分別擴(kuò)增輕鏈及重鏈基因。
　　4.使用ApaLⅠ和AscⅠ內(nèi)切酶，對(duì)輕鏈基因及pHD載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切。使用NotⅠ和SiiⅠ內(nèi)切酶酶切重鏈基因。
　　5.將輕鏈基因酶切片段與載體質(zhì)粒連接，脫鹽純化后電轉(zhuǎn)SS32

26、0細(xì)胞。
　　6.測(cè)定輕鏈子庫庫容并進(jìn)行測(cè)序鑒定，鑒定合格后提取輕鏈子庫質(zhì)粒。
　　7.使用NotⅠ和SfiⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切輕鏈子庫質(zhì)粒。然后將已酶切之重鏈基因連接導(dǎo)入輕鏈子庫。
　　8.測(cè)定Fab抗體庫庫容，挑取Fab抗體文庫菌落，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)其抗體基因完整性與文庫多態(tài)性、抗體基因種源及其Germline亞型進(jìn)行分析。
　　9.Fab抗體庫經(jīng)復(fù)蘇、接種培養(yǎng)、輔助噬菌體侵染、篩選擴(kuò)培，完成噬菌體展示抗體庫營救

27、擴(kuò)培。
　　10.進(jìn)行噬菌體海選、淘選，營救與擴(kuò)增，ELISA初篩及確認(rèn)，陽性克隆抗體誘導(dǎo)表達(dá)。
　　11.菌液裂解上清與A*24∶191表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫印跡法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠免疫血清檢測(cè)結(jié)果顯示3號(hào)小鼠免疫血清效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.瓊脂糖凝膠電泳顯示小鼠RNA提取質(zhì)量、輕鏈和重鏈基因擴(kuò)增及酶切結(jié)果符合要求。
　　3.輕鏈子庫測(cè)定庫容為3.6×106pfu，測(cè)序分析顯示其抗體基因正確

28、插入率為86％(6/7)。
　　4.Fab抗體庫測(cè)定庫容為4.4×107pfu，測(cè)序分析顯示其抗體基因正確插入率為80％(16/20)?？贵w重鏈序列分析顯示其均為鼠源性抗體序列，Germline亞型分析顯示其70％(7/10)分布在IGHV1家族，表明抗體基因完整性與文庫多態(tài)性均應(yīng)大于80％。
　　5.經(jīng)噬菌體展示抗體庫營救、噬菌體海選、ELISA初篩及確認(rèn)，選擇一株單克隆菌液裂解上清與A*24∶191表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫印跡法