豬Toll樣受體7基因的克隆、表達(dá)及其結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測分析.pdf

1、Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)是介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的病原模式識別受體家族，主要參與對微生物病原體相關(guān)分子模式的識別，其中Toll樣受體7(TLR7)在ssRNA病毒的識別及其感染的信號傳遞中起重要作用。目前，對人和鼠的(TLR7的研究已取得了一定的進(jìn)展，但對豬、牛和家禽等動物的TLR7分子結(jié)構(gòu)與功能的研究很少。由于TLR7分子在物種間既存在相似性，又存在種屬差異性，因此，對豬TLR7分子的研究具有

2、重要科學(xué)價(jià)值。 1.本研究從經(jīng)植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)聯(lián)合刺激的豬脾臟淋巴細(xì)胞中，提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)，在國內(nèi)首次克隆了豬Toll樣受體7全長基因。該基因ORF為3153bp，編碼1050個(gè)氨基酸，富含16.2％的亮氨酸，是一個(gè)含26個(gè)氨基酸信號肽序列的，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成的Ⅰ型跨膜蛋白受體，與GenBank上登載的豬參考序列(DQ_333222)的同源性為98.8％。將所克隆的豬Toll樣

3、受體7基因的核苷酸序列與其它動物的進(jìn)行遺傳演化分析，發(fā)現(xiàn)豬與牛和綿羊的同源性較高，與馬、貓、人、鼠的次之，表明TLR7基因系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系上與物種之間的親緣關(guān)系密切。同時(shí)，構(gòu)建了pcDNA3.1/CT-GFP-pTLR7真核表達(dá)載體，測序鑒定后，提取重組質(zhì)粒后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果表明，pTLR7-GFP融合蛋白得到成功表達(dá)。 2.TLR7胞外區(qū)是識別和傳導(dǎo)病原模式分子配體信息的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)域，包含有L

4、RR基序(XLXXLXLXX)，本研究克隆該基因的胞外區(qū)片段2451bp，與pMAL-c2x質(zhì)粒載體一起分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)酶切、PCR以及測序鑒定證明，豬TLR7基因正確插入到pMAL-c2x載體。重組菌經(jīng)ITPG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析表明：MBP-pTLR7基因胞外區(qū)融合蛋白主要以包涵體形式存在，分子量約為136kDa，說明已成功表達(dá)了pTLR7基因的胞外區(qū)分子片段。

5、 3.將TLR7全長基因和pcDNA3.1質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)鑒定證明，豬TLR7全長基因正確插入到pcDNA3.1載體;用重組質(zhì)粒和復(fù)性后的MBP-pTLR7基因胞外區(qū)融合蛋白，分別免疫BALB/c小鼠，采用間接ELISA方法檢測特異性抗體表明：BALB/c小鼠在免疫后產(chǎn)生了較高的抗豬TLR7分子的多克隆抗體，其效價(jià)顯著高于對照組，說明成功研制了小鼠抗豬TLR7全長分子及胞外區(qū)分子片段的多