仿刺參Toll樣受體家族基因的克隆、進(jìn)化與表達(dá)分析.pdf

1、仿刺參(Apostichopus japonicus)屬于棘皮動(dòng)物門,海參綱,仿刺參屬,是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。針對(duì)仿刺參免疫基因及其應(yīng)答機(jī)制的研究將為病害預(yù)防奠定理論基礎(chǔ)。
　　Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是I型跨膜蛋白,屬于先天性免疫系統(tǒng)中最古老的模式識(shí)別受體。本實(shí)驗(yàn)采用RACE方法,首次從仿刺參體腔細(xì)胞中克隆得到了兩個(gè)TLRs的cDNA全長。將兩條序列分別進(jìn)行BLASTX比對(duì),結(jié)果顯示一條序列

2、和不同物種的TLR3序列相似,另一條序列和不同物種的Toll序列相似,因此分別命名為AjTLR3和AjToll。AjTLR3的cDNA全長為3483bp,開放閱讀框長2679bp,編碼892個(gè)氨基酸;AjToll的cDNA全長為4211bp,開放閱讀框長2853bp,編碼950個(gè)氨基酸。用SMART軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測,AjTLRs都具有典型的TLR結(jié)構(gòu):胞外亮氨酸重復(fù)序列LRR(Leucine-rich repeat,LRR)區(qū),跨膜區(qū)(

3、Transmembrane,TM)和胞內(nèi)TIR(Toll/interleukin-1 receptor)區(qū),說明TLR在脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中是高度保守的。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)AjTLR3和AjToll分別與脊椎動(dòng)物類TLR(Vertebrate-like TLRs,V-TLRs)和原口動(dòng)物類 TLR(Protostome-like TLRs,P-TLRs)聚集在一起,表明仿刺參中存在兩種不同類型的TLRs。文中采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的方法檢

4、測兩個(gè)基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量以及免疫刺激后各組織表達(dá)量的變化情況。結(jié)果顯示,兩個(gè)AjTLRs在體壁、體腔細(xì)胞、管足、腸和呼吸樹中都有表達(dá),并且在呼吸樹中表達(dá)量最高,而在其它組織中表達(dá)量相對(duì)較低。通過對(duì)仿刺參病害方面的研究總結(jié)發(fā)現(xiàn),目前所鑒定出的病原物主要有革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒。因此本實(shí)驗(yàn)采用了四種病原物的類似物:肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、酵

5、母聚糖(Zymosan A)和聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)對(duì)仿刺參進(jìn)行體腔免疫刺激。熒光定量結(jié)果分析表明這兩個(gè)基因在不同的組織中針對(duì)不同的刺激所呈現(xiàn)的表達(dá)模式不同:在PGN的刺激下,AjTLRs在體腔細(xì)胞中的表達(dá)變化最顯著;在LPS和PolyI:C刺激下,AjTLRs在管足中表達(dá)變化最顯著;在Zymosan A的刺激下,AjTLRs在呼吸樹中表達(dá)變化最顯著,由此推測AjT