石磺進(jìn)化相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、進(jìn)化論觀點(diǎn)認(rèn)為生命起源于海洋，生物從水棲向陸棲進(jìn)化，兩棲類是進(jìn)化過程中產(chǎn)生的過渡態(tài)物種。石磺科(Onchidiidae)貝類，隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、肺螺亞綱（Pulmonata）、縮眼目（Systellommatophora），其幼蟲生活在水中，變態(tài)發(fā)育后具有明顯的兩棲性，被認(rèn)為是無脊椎動(dòng)物由淺海向陸地進(jìn)化的過渡類群，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。我國(guó)華東地區(qū)分布著瘤背石磺（Onchidium st

2、ruma）、平疣桑椹石磺（Platevindex mortoni）、里氏擬石磺（Paraoncidium reevesii）和紫色疣石磺（Peronia verruculata），生存環(huán)境由潮間帶向潮上帶遷移，產(chǎn)生出具有時(shí)空代表性的表型差異。本論文依據(jù)石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，開發(fā)出四種石磺間表型進(jìn)化相關(guān)基因，Os-NMHC,Os-RYR,Os-IP3R，Os-MEK,Os-IP3K的cDNA序列，通過RT-PCR技術(shù)探究基因的種間差異表達(dá)趨勢(shì)

3、，從基因表達(dá)水平探究石磺表型進(jìn)化差異的同時(shí)，也初步地探究了NMHC基因亞型進(jìn)化節(jié)點(diǎn)問題以及相似鈣調(diào)蛋白R(shí)YR和IP3R基因的進(jìn)化趨勢(shì)。
　　首次于石磺科貝類中克隆出一條差異表達(dá)的Ⅱ型非肌肉型肌球蛋白重鏈基因(NMHCⅡ)的cDNA全長(zhǎng)，將其命名為Os-NMHC基因。其序列全長(zhǎng)6057bp，包括5733bp的開放閱讀框，236bp的5’端非翻譯區(qū)，88bp的3’端非翻譯區(qū)，共編碼1910個(gè)氨基酸；預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.26，相對(duì)分子

4、質(zhì)量為220.46KD；通過Phyre2程序和Pymol軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)圖，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和β折疊為主；通過Clustalx和dnaMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與爪蟾NMHC II A序列一致度為60.37％，與爪蟾NMHC II B序列相似度為61.47%；通過Bayes軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其與加州海兔親緣關(guān)系最近。通過QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因在四種石磺的背部、腹部、腹足部、肺囊、心臟、神經(jīng)節(jié)中

5、均有不同程度的表達(dá)。種間表達(dá)水平與進(jìn)化趨勢(shì)相一致，依次為：瘤背石磺≥平疣桑椹石磺>里氏擬石磺>紫色疣石磺。對(duì)于石磺Os-NMHC基因的研究，將有助于NMHC亞型進(jìn)化節(jié)點(diǎn)問題的探究，并為石磺科貝類由淺海向濕地進(jìn)化的機(jī)制研究提供新視角。
　　RYR和IP3R是兩種結(jié)構(gòu)相似、功能相近的鈣調(diào)蛋白，通過RACE技術(shù)于瘤背石磺中開發(fā)出Os-RYR和Os-IP3R的cDNA3’末端保守區(qū)序列。Os-RYR核酸序列1253bp,包括83bp的3’

6、非編碼區(qū)，翻譯氨基酸殘基376個(gè)，與加州海兔RYR末端保守區(qū)序列一致度為94%。Os-IP3R核酸序列4574bp，包括1561bp的3’非編碼區(qū)，翻譯936個(gè)氨基酸殘基，與加州海兔IP3R末端保守區(qū)序列一致度為85%。Clustal omega在線比對(duì)，Os-RYR和Os-IP3R鈣離子通道在GXRXGGGXGD處的序列高度保守，證明該序列對(duì)于形成離子通道具有重要作用。Os-IP3R離子通道保守區(qū)與加州海兔IP3R離子通道保守區(qū)序列相

7、似度為94%，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)重合度極高。QRT-PCR分析結(jié)果顯示，Os-RYR和Os-IP3R在紫色疣石磺中表達(dá)水平均最低，Os-RYR在石磺物種間的表達(dá)水平不具有梯度趨勢(shì)，Os-IP3R在瘤背石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺中表達(dá)量呈梯度下降趨勢(shì)。Os-IP3R/Os-RYR表達(dá)百分比在紫色疣石磺、平疣桑椹石磺、瘤背石磺中呈梯度上升趨勢(shì)，說明功能相同結(jié)構(gòu)相似的兩種鈣調(diào)蛋白基因Os-IP3R和Os-RYR，在石磺由淺海向濕地進(jìn)化過程中，

8、對(duì)Os-IP3R的鈣調(diào)功能呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其表達(dá)具有一定得趨向性。
　　以高等動(dòng)物VEGF信號(hào)通路分子為基礎(chǔ)，結(jié)合石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，認(rèn)為石磺中VEGF信號(hào)通路(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路)中不存在IP3K/AKT和mTOR通路途徑，并篩選出與鈣調(diào)蛋白Os-IP3R具有互作關(guān)系的Os-IP3K通路分子以及表皮生長(zhǎng)相關(guān)的下游通路分子Os-MEK。克隆瘤背石磺Os-MEK核酸序列全長(zhǎng)1201bp，包括40bp5’的非編碼區(qū)和83bp的3’

9、非編碼區(qū)，共編碼368個(gè)氨基酸殘基，與加州海兔MEK基因編碼氨基酸序列一致度達(dá)到82%。Os-MEK蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和少量無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。克隆Os-IP3K核酸序列全長(zhǎng)3661bp，不包括3’和5’端非編碼區(qū),編碼721個(gè)氨基酸殘基。RT-PCR分析結(jié)果顯示Os-IP3K在瘤背石磺各組織中的表達(dá)趨勢(shì)與Os-IP3R表達(dá)趨勢(shì)一致。在平疣桑椹石磺神經(jīng)節(jié)中不表達(dá)Os-IP3R，但是Os-IP3K的表達(dá)水平卻是各組織