白靈側(cè)耳結(jié)實(shí)相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、白靈側(cè)耳(Pleurotus eryngii var.moliensis C.J.Mou)營(yíng)養(yǎng)豐富、藥用價(jià)值高，深受人們喜愛，但由于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、菇蕾發(fā)育同步性差、畸形菇嚴(yán)重，致使栽培經(jīng)濟(jì)效益較低，嚴(yán)重影響了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此培育原基發(fā)生早、原基發(fā)生整齊的新品種已成當(dāng)務(wù)之急。在傳統(tǒng)育種的基礎(chǔ)上結(jié)合并發(fā)揮分子育種的優(yōu)勢(shì)加快育種進(jìn)度成為必然。闡明白靈側(cè)耳結(jié)實(shí)的分子機(jī)理是開展分子輔助育種首要解決的問題，而結(jié)實(shí)分子機(jī)理研究的第一步就是尋找與其結(jié)實(shí)相

2、關(guān)的關(guān)鍵基因。
　　 本研究以白靈側(cè)耳菌絲和原基為材料，利用LiCl沉淀法對(duì)兩階段的RNA進(jìn)行提取并純化，然后利用3條錨定引物和26條隨機(jī)引物組成的78個(gè)引物組合對(duì)兩個(gè)發(fā)育階段cDNA進(jìn)行差異顯示PCR擴(kuò)增，并用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對(duì)兩發(fā)育階段的差異片段進(jìn)行篩選，對(duì)獲得的差異片段進(jìn)行切膠回收并純化，將純化片段克隆測(cè)序后重新設(shè)計(jì)引物，并以beta-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用半定量PCR的方法驗(yàn)證差異片段的真實(shí)

3、性，最后應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)真實(shí)的差異片段進(jìn)行同源性分析并對(duì)基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　 引物篩選結(jié)果表明，78個(gè)引物組合中，錨定引物H-T11A組成的引物對(duì)擴(kuò)增出的差異條帶最多，效果最好，其余兩個(gè)效果較差。
　　 結(jié)實(shí)相關(guān)基因片段克隆及序列分析結(jié)果顯示，在菌絲和原基兩個(gè)發(fā)育階段中最終共獲得8條差異片段，差異條帶大小多在200-500bp之間。1條與未知蛋白具有40％氨基酸同源性的基因片段在菌絲中高表達(dá)，其余7條在原基中高表