秀珍菇變溫結(jié)實(shí)相關(guān)Ppcsl-1基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、出菇結(jié)實(shí)(fruiting-body forming)是食用菌繁殖后代的重要生命現(xiàn)象。食用菌的出菇受溫度、濕度、光照和二氧化碳濃度等環(huán)境因素的深刻影響。一些食用菌必需受低溫刺激才能使成熟菌絲從營(yíng)養(yǎng)期轉(zhuǎn)向繁殖期，這種獨(dú)特轉(zhuǎn)變稱(chēng)為“變溫結(jié)實(shí)”。該特殊生物學(xué)現(xiàn)象，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食用菌的生產(chǎn)實(shí)踐中，但是其分子機(jī)制尚不清楚。
　　秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）又名袖珍菇、肺形側(cè)耳、鳳尾菇等，隸屬真菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、傘菌

2、目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬?！稗r(nóng)秀1號(hào)”是浙江省農(nóng)科院通過(guò)雜交選育獲得的秀珍菇高溫型新品系，其具有典型短暫冷刺激誘導(dǎo)子實(shí)體形成的特點(diǎn)，是研究食用菌變溫結(jié)實(shí)的理想材料。前期研究獲得了秀珍菇變溫結(jié)實(shí)相關(guān)的消減雜交文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)變溫結(jié)實(shí)過(guò)程不僅涉及到下游代謝途徑相關(guān)基因和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)水平變化，而且涉及到上游多個(gè)甚至全局性調(diào)控基因的表達(dá)變化。其中轉(zhuǎn)錄因子在這一重要的生命進(jìn)程中扮演關(guān)鍵角色。因而轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能鑒定將會(huì)為食用菌變溫結(jié)實(shí)分子機(jī)

3、制的研究提供重要線(xiàn)索。
　　本研究已從該文庫(kù)中篩選獲得一個(gè)相關(guān)csl因(屬于CSL(CBF1/RBP-Jκ/Suppressor of Hairless/LAG-1)轉(zhuǎn)錄因子家族）EST序列，結(jié)合前人報(bào)道，該基因可能參與秀珍菇發(fā)育、細(xì)胞分化及細(xì)胞粘附，是具有重要意義的轉(zhuǎn)錄因子基因。本研究將通過(guò)克隆分析該基因，希望能夠?yàn)樽儨亟Y(jié)實(shí)這一復(fù)雜過(guò)程的分子機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)TAIL PCR技術(shù)克隆了秀珍菇csl基因（P

4、leurotus pulmonariuscsl-1，簡(jiǎn)寫(xiě)為pcsl-1），Ppcsl-1基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。利用RACE技術(shù)獲得該基因的eDNA全長(zhǎng)。Ppcsl-1基因的CDS序列全長(zhǎng)2991bp，編碼一個(gè)996氨基酸組成的蛋白（命名為PpCSL-1）。PpCSL-1含有LAG1、BTD和IPT三個(gè)結(jié)構(gòu)域，其DNA結(jié)合位點(diǎn)非常保守。PpCSL-1為親水性蛋白，但包含一個(gè)明顯的疏水結(jié)構(gòu)，該疏水結(jié)構(gòu)位于BTD結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明該蛋白

5、可能是跨膜蛋白或者可與膜結(jié)合的一類(lèi)蛋白。選擇30個(gè)真菌和后生動(dòng)物的CSL，構(gòu)建了CSL的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并對(duì)這些CSL的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了比較分析，分析顯示CSL在進(jìn)化過(guò)程中結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合位點(diǎn)都比較保守。進(jìn)化分析顯示，在擔(dān)子菌CSL中，PpCSL-1與糙皮側(cè)耳JPleurotus ostreatus CSL(PoCSL)親緣關(guān)系最近。通過(guò)熒光定量技術(shù)和geNorm軟件對(duì)ACT、GAPDH、eIF5、TUA、ATPase、RPL14等6個(gè)管

6、家基因在秀珍菇不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，這些基因的表達(dá)穩(wěn)定性平均值M分布在0.496至1.025之間，分別為RPL14(0.496)＞ATPase(0.536)＞eIF5(0.551)＞ACT(0.702)＞TUA(0.717)＞GAPDH(1.025)，其中RPL14的M值最低，說(shuō)明其表達(dá)最穩(wěn)定。以RPL14基因作參考基因，熒光定量檢測(cè)Ppcsl-1基因在營(yíng)養(yǎng)菌絲期、冷處理12h、原基期、珊瑚期和子實(shí)體期等不同發(fā)