平菇幾丁質(zhì)酶基因PoChil的克隆與分析.pdf

1、幾丁質(zhì)酶(chitinase)通過參與真菌細(xì)胞壁的合成與降解，在真菌形態(tài)發(fā)生和生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用。尚沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)平菇幾丁質(zhì)酶基因的研究和報(bào)道。本研究克隆了平菇幾丁質(zhì)酶基因PoChi1，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并在E.coli BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了原核表達(dá);通過半定量RT-PCR的方法研究了PoChi1的表達(dá)模式;構(gòu)建了過量表達(dá)載體和反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化平菇菌絲塊，利用潮霉素抗性篩選及PCR檢測得到了陽性轉(zhuǎn)化子;分析了

2、轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株的差異。初步研究了PoChi1對平菇形態(tài)發(fā)生和生長發(fā)育的調(diào)控作用，研究的主要結(jié)論如下:
　　1.提取平菇菌絲總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄PCR方法，首次克隆得到了平菇幾丁質(zhì)酶基因PoChi1。生物信息學(xué)分析表明，編碼序列長1，188 bp，翻譯395個(gè)氨基酸，包含信號肽、三個(gè)高度保守的區(qū)域和短的C端區(qū)域。POCHI1二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明其具有18家族的幾丁質(zhì)酶相似的(βα)8的圓桶形結(jié)構(gòu)，建樹分析表明POCHI1可

3、歸屬于Ⅲ類幾丁質(zhì)酶。
　　2.構(gòu)建了原核表達(dá)載體，在E.coli BL21(DE3)實(shí)現(xiàn)了原核表達(dá)，SDS-PAGE分析表明PoChi1編碼蛋白的相對分子量約為29 kDa，測定的粗酶液酶活為2.172 U·mL-1。半定量RT-PCR分析該基因在平菇不同生長階段表達(dá)模式表明，PoChi1在平菇成熟期表達(dá)水平最高，該基因在平菇子實(shí)體生長發(fā)育過程中可能起了一定作用。
　　3.利用平菇內(nèi)源gpd啟動子，構(gòu)建了PoChi1過量表達(dá)

4、載體pBHg-gpt和反義表達(dá)載體pBHg-gfpt。
　　4.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將pBHg、pBHg-gpt和pBHg-gfpt轉(zhuǎn)入到平菇新831菌株中。在含有100μg·mL-1潮霉素的PDA培養(yǎng)基上初步篩選分別得到3、4、6株擬轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定后得到3、2、1株陽性轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)PoChi1的平菇菌株P(guān)g比出發(fā)菌株菌絲長勢好;沉默表達(dá)PoChi1勺平菇菌株P(guān)g比出發(fā)菌株菌絲長

5、勢差。推測幾丁質(zhì)酶基因可能影響平菇菌絲生長發(fā)育。
　　綜上所述，本研究從平菇中首次克隆到了幾丁質(zhì)酶基因PoChi1，生物信息學(xué)分析顯示屬于Ⅲ類幾丁質(zhì)酶基因。在大腸桿菌BL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)并檢測到幾丁質(zhì)酶活性。PoChi1在平菇不同生長階段的表達(dá)模式和該基因在平菇轉(zhuǎn)化子中的過量和沉默表達(dá)結(jié)果表明，平菇幾丁質(zhì)酶基因可能參與了子實(shí)體生長發(fā)育和菌絲生長發(fā)育過程。對該基因功能的進(jìn)一步研究，將可能揭示幾丁質(zhì)酶基因與平菇