isoptericolajiangsuensissp.nov.的分離、鑒定及其幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文Isoptericolajiangsuensissp.nov.的分離、鑒定及其幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)姓名：吳瑩申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：沈標(biāo)201007Isoptericolafiangsuensisspnov的分離、鑒定及其幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)化后的培養(yǎng)基配方為：細(xì)粉幾丁質(zhì)075％(w／v)，(NH4)2S04o1％(w／v)，KH2P04005％(w／v)，NaCl005％(w／v)，K

2、2IIP04015％(w／v)，MgSOa0002％(w／v)。在該條件下，幾丁質(zhì)酶活達(dá)到1972U／mL，比在原培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下的酶活力提高了12倍。利用幾丁質(zhì)酶編碼基因的特異性引物從CLG基因組DNA中擴(kuò)增出了一段274bp的幾丁質(zhì)酶基因的保守片段(chiACF)。在此基礎(chǔ)上，利用SEFAPCR獲得長為5233bp的DNA片段，序列分析顯示該DNA片段上存在2個相連的開放閱讀框ORFl和ORF2。序列同源性比較發(fā)現(xiàn)ORFl和ORF

3、2分別為幾丁質(zhì)酶基因chiA和chiB。其中，砌逸由2616個核苷酸組成，編碼871個氨基酸(啪，將其編碼的幾丁質(zhì)酶命名為IschiA；chiB由1686個核苷酸組成，編碼561個aa，將其編碼的幾丁質(zhì)酶命名為Is—chiB。IschiA由一個信號肽、兩個typelII型幾丁質(zhì)結(jié)合域和一個18家族糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域組成；而幾丁質(zhì)酶IschiB則由一個信號肽和一個18家族糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域組成。IschiA和IschiB與Arthrobact

4、erspTAD20的幾丁質(zhì)酶ArChiA和ArChiB分別顯示出了58％扣62％的同源性。將幽iA、chiB兩個基因分別克隆到pET28a()載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒p28chiA乖p28chiB，轉(zhuǎn)入EcoliBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后經(jīng)SDSPAGE分析，可見分子量約為92kDa和60kDa的蛋白IschiA和IschiB。IschiA和IschiB分別具有外切型幾丁二糖酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的活性，兩者均無N乙酰葡荀糖胺酶活性。通

5、過鎳柱對IschiA和IschiB進(jìn)行了純化，并對兩者的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。IschiA最適反應(yīng)溫度為30℃，其在40℃以下范圍內(nèi)較穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH值為50，在pH458o的條件下比較穩(wěn)定，ca2、Ba2、zn2(O1mM10mM)對其有激活作用，Ni(o1mM10mM)影響不大，Md，Li，Mn2，Cu2，C02，F(xiàn)e3，c，，Pb2，cd2(01mlVl10mM)則對其均有一定的抑制作用，EDTA存在時，IschiA的酶活稍有增加

6、。Is—chiA對底物4MU(NAG)2的Km為679gmLd(1166lunolL1)，Vmax為1093岬olmilllmfl。IsclliB最適反應(yīng)溫度為50℃，在30℃以下范圍內(nèi)較穩(wěn)定，最造反應(yīng)pH值為90，在pH70100的條件下較穩(wěn)定，除C02和c一外，其它各種濃度(O1mM10mM)的試驗(yàn)金屬離子對IschiB均有激活作用，當(dāng)EDTA存在時，酶活稍有下降。IschiB對底物4MU(NAG)3的Kra為1338xgmL以(1