暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶基因hpChi的克隆、表達(dá)及活性分析.pdf

1、幾丁質(zhì)(chitin)是N-乙酰氨基葡萄糖的同聚物，在昆蟲生長發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，幾丁質(zhì)的含量和分布都需要相應(yīng)發(fā)生變化。幾丁質(zhì)酶(chitinase)屬水解酶類，能夠?qū)锥≠|(zhì)長鏈降解為寡聚物。昆蟲幾丁質(zhì)酶存在于昆蟲的中腸、蛻皮液及某些昆蟲的毒腺中，表達(dá)水平隨昆蟲不同生長發(fā)育階段而變化，對(duì)昆蟲幾丁質(zhì)的代謝起重要調(diào)控作用。
　　為了得到鞘翅目特異性幾丁質(zhì)酶基因，本研究免疫篩選已構(gòu)建的暗黑鰓金龜(Holotrichia parallela

2、Motschulsky)中腸cDNA表達(dá)文庫，得到暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶基因，命名為hpChi，并對(duì)其特性進(jìn)行分析。hpChi基因全長1591bp，開放讀碼框(ORF)1443bp，編碼480個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量大小為51.4kDa，等電點(diǎn)(pI)為5.08。氨基酸序列分析顯示其具有3個(gè)區(qū)域組成的多功能區(qū)結(jié)構(gòu)，分別為N-端的酶活性催化區(qū)（catalytic domain），C-端富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)(chitin-binding d

3、omain，CBD)及富含絲氨酸和蘇氨酸的連接區(qū)(Linker)。
　　利用PDB網(wǎng)站對(duì)HpChi蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，表明HpChi蛋白具有幾丁質(zhì)酶第18家族（Family18）典型的“(β/α)8圓桶型結(jié)構(gòu)”。利用NCBI網(wǎng)站和MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示暗黑鰓金龜幾丁質(zhì)酶HpChi與近緣種的華北大黑鰓金龜親緣關(guān)系最近，其次與直翅目東亞飛蝗（Locusta migratoriamanilensis）和鞘翅目赤擬谷盜（Tr

4、ibolium castaneum）親緣關(guān)系較近，與鞘翅目昆蟲黃粉蟲（Tenebrio molitor）、墨松天牛（Monochamus alternatus）、辣根猿葉甲（Phaedoncochleariae）統(tǒng)屬一大類，與膜翅目和鱗翅目昆蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET30a-hpChi，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western Blot分析，成功表達(dá)分子量51.4k

5、Da的幾丁質(zhì)酶蛋白，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。將以包涵體形式存在的外源蛋白HpChi超聲破碎后，通過Ni+-NTA樹脂親和層析純化蛋白，并制備多克隆抗體。
　　構(gòu)建重組酵母表達(dá)載體pPICK9K-hpChi，轉(zhuǎn)化缺陷性畢赤酵母GS115，經(jīng)抗性篩選、表型和分子鑒定表明重組酵母GS115（pPICK9K-hpChi）構(gòu)建成功。但甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，Western Blot檢測(cè)未能成功表達(dá)目的蛋白。
　　構(gòu)建真核（重組桿狀病毒）表達(dá)載體pFa

6、st-hpChi，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac，利用其載體自帶質(zhì)粒轉(zhuǎn)座將目的基因插入Bacmid桿狀病毒進(jìn)一步構(gòu)建得到Bacmid-hpChi。轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞（草地貪夜蛾細(xì)胞系sf9），分別獲得P1、P2、P3病毒，取上清進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，證明HpChi在昆蟲細(xì)胞sf9中獲得成功表達(dá)。以幾丁質(zhì)為底物通過DNS比色檢測(cè)還原糖的原理測(cè)定細(xì)胞表達(dá)的幾丁質(zhì)酶的酶活，結(jié)果顯示其有幾丁質(zhì)酶的活性并且在微酸環(huán)境下活性較強(qiáng)。
　　本研