華北大黑鰓金龜絲氨酸羧肽酶HoSCP的表達及活性分析.pdf

1、華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita Faldermann)屬鞘翅目(Coleoptera)金龜總科(Scarabaeoidea)昆蟲，幼蟲稱為蠐螬，是世界公認的危害嚴重且難于防治的地下害蟲類群之一。其主要分布于中國北方的河北、山東、山西、河南、遼寧西部等省，主要為害花生等農(nóng)作物、草坪苗圃及林木葉片果實等。
　　 昆蟲中腸蛋白酶在昆蟲食物蛋白質(zhì)消化方面具有非常重要的功能，是昆蟲生長發(fā)育的必須酶類。絲氨酸羧肽酶(S

2、erine carboxypeptidases，SCPs)是一類真核生物蛋白水解酶，可參與多種生理及細胞多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾與降解等代謝過程。目前，對其結(jié)構和功能的研究主要集中于酵母和高等植物中，而在昆蟲中的研究甚少，只有少數(shù)幾個絲氨酸羧肽酶的序列及生物學功能得到鑒定。
　　 本研究以本實驗室前期從華北大黑鰓金龜中腸cDNA表達文庫中篩選得到的絲氨酸羧肽酶HoSCP為研究對象，設計引物擴增hoscp基因的開放閱讀框序列，構建

3、重組表達載體pPICK9K-hoscp，并將其轉(zhuǎn)化到缺陷型畢赤酵母菌株GS115中進行誘導表達。結(jié)果顯示，重組絲氨酸羧肽酶HoSCP在重組酵母菌株甲醇誘導培養(yǎng)24 h后開始分泌表達，72 h時表達量達到最大，表達50 kDa蛋白，與預測分子量相符。以重組酵母菌株甲醇誘導72 h后所得上清液作為粗酶液，測定重組絲氨酸羧肽酶HoSCP的活力為0.033U，比活力為0.165 U/mL。
　　 通過提取不同齡期華北大黑鰓金龜幼蟲的中腸

4、及其內(nèi)容物，測定相應絲氨酸羧肽酶的活力及比活力。結(jié)果表明，華北大黑鰓金龜3齡中期幼蟲中腸絲氨酸羧肽酶最適pH值為8.0，對應活力為0.004 U，比活力為0.020 U/mg。2齡、3齡初期幼蟲中腸絲氨酸羧肽酶的比活力均顯著高于相同齡期末期幼蟲蛻皮前的絲氨酸羧肽酶活性，分別是2倍左右。其中，3齡初期幼蟲中腸絲氨酸羧肽酶活性最高，為0.0068 U/mg。
　　 本實驗實現(xiàn)了華北大黑鰓金龜絲氨酸羧肽酶HoSCP在畢赤酵母菌株中的外