華北大黑鰓金龜OBPs異源二聚體對氣味分子的識別機制.pdf

1、華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita Faldermann)隸屬鞘翅目，鰓金龜科，其幼蟲蠐螬，是花生、大豆、小麥、玉米、馬鈴薯等作物的重要地下害蟲，危害嚴重，防治困難。采用“地下害蟲，地上防治”、“防治成蟲，控制幼蟲”的策略，尋找一種高效、無污染的華北大黑鰓金龜成蟲防治新途徑已成為當(dāng)務(wù)之急，其中利用寄主植物的揮發(fā)物誘殺成蟲是目前華北大黑鰓金龜防治的一種潛在綠色防控技術(shù)。本文以闡明其成蟲觸角中兩種氣味結(jié)合蛋白(HoblOB

2、P1和HoblOBP2)的互作能增強對氣味化合物的結(jié)合能力為目標;通過熒光原位雜交技術(shù)證明了HoblOBP1和HoblOBP2在成蟲觸角中的共表達;利用蛋白分子對接技術(shù)對兩蛋白的結(jié)合模式及其兩蛋白復(fù)合物與氣味分子的關(guān)鍵結(jié)合位點進行預(yù)測與分析;采用定點突變技術(shù)，獲得特定的突變基因，進而表達純化以獲得不同的突變蛋白;通過熒光結(jié)合實驗明確不同結(jié)合位點在HoblOBP1/OBP2復(fù)合物識別活性氣味分子中的影響，從而解析OBPs異源二聚體的形成機

3、制及其對氣味分子的識別機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.熒光原位雜交實驗表明HoblOBP1和HoblOBP2在華北大黑鰓金龜?shù)挠|角感器中共表達。
　　2.HoblOBP1和HoblOBP2對接后，構(gòu)建了HoblOBP1/OBP2復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)模型。研究發(fā)現(xiàn)HoblOBP1、HoblOBP2和HoblOBP1/OBP2的結(jié)合口袋分別由68、77和79個氨基酸殘基組成。尤為重要的是，HoblOBP1/OBP2復(fù)合物的結(jié)合口袋

4、明顯大于任一單一蛋白的結(jié)合口袋，其主要由HoblOBP2提供，HoblOBP1僅提供了一部分。
　　3.在HoblOBP1和HoblOBP2構(gòu)建的蛋白復(fù)合物的結(jié)合口袋分析中，發(fā)現(xiàn)HoblOBP1的三個氨基酸殘基Asp61、Gly85和Ile87分別與HoblOBP2的Tyr86、Ile75和Asn74相互作用形成了3對氫鍵。本實驗通過單點突變(HoblOBP1中的Gly85，HoblOBP2中的Asn74和Tyr86)和雙點突變（

5、HoblOBP2中的Asn74和Tyr86）的方式來實現(xiàn)兩個蛋白間的一對、兩對或三對氫鍵的斷裂。熒光結(jié)合實驗結(jié)果表明3對氫鍵均斷裂后，其與探針1-NPN的結(jié)合曲線和Scatchard方程分別呈現(xiàn)上升趨勢和線性相關(guān)，蛋白混合物與反-2-己烯醇、1-庚醛、R-（-）-芳樟醇和α-松油醇完全不能結(jié)合。當(dāng)斷裂1對或2對氫鍵時，所有的蛋白混合物與1-NPN的結(jié)合曲線和Scatchard方程分別表現(xiàn)下降趨勢和“J”形狀的向下凹的曲線，帶有HoblO

6、BP1上G85A突變位點的蛋白混合物與化合物仍有較弱的結(jié)合能力。由此表明三對氫鍵均對蛋白復(fù)合物與化合物結(jié)合產(chǎn)生影響，但與HoblOBP2-Tyr86/HoblOBP1-Asp61和HoblOBP2-Asn74/HoblOBP1-Ile87這兩對氫鍵相比，HoblOBP1-Gly85/HoblOBP2-Ile75的影響較小。
　　4.在蛋白復(fù)合物與四種配體對接分析中，發(fā)現(xiàn)HoblOBP2中的Asn54、Thr71、Asn74、Leu

7、126和Asn127等氨基酸殘基均參與了蛋白與配體間氫鍵的形成。此外，配體分子周圍存在的疏水殘基參與了配體和蛋白的結(jié)合作用，這些疏水殘基主要有HoblOBP1中的Val86，HoblOBP2中的Leu59和Met117。對HoblOBP2中的5個氫鍵形成的位點(Asn54，Thr71，Asn74，Leu126和Asn127)和HoblOBP1中的1個疏水位點(Val86)進行單點突變;對蛋白復(fù)合物與反-2-己烯醇結(jié)合的雙氫鍵位點（Hob

8、lOBP2中的Leu126和Asn127），以及與α-松油醇結(jié)合的雙氫鍵位點（HoblOBP2中的Thr71和Asn74）進行雙點突變。熒光結(jié)合實驗結(jié)果表明5個氫鍵形成位點分別突變成丙氨酸后，蛋白混合物與化合物結(jié)合能力顯著減弱;疏水位點突變后，二者之間仍存在一定的親和性;由此說明蛋白與配體間的疏水鍵對兩者之間的結(jié)合作用的影響弱于氫鍵。雙點突變后，蛋白混合物對化合物完全不能結(jié)合;另外，所有突變蛋白混合物與與1-NPN的結(jié)合曲線和Scatc

9、hard方程分別表現(xiàn)下降趨勢和“J”形狀的向下凹的曲線。
　　本文解析了華北大黑鰓金龜HoblOBP1和HoblOBP2異源二聚體對氣味分子的識別機制，其中兩個蛋白之間形成的3對氫鍵是HoblOBP1與HoblOBP2能夠形成異源二聚體的關(guān)鍵作用力，同時顯著影響蛋白復(fù)合物對化合物結(jié)合能力。蛋白復(fù)合物與4種化合物之間形成的氫鍵作用是其與化合物能夠結(jié)合的關(guān)鍵因素，形成氫鍵作用的5個氨基酸位點為蛋白復(fù)合物識別活性氣味分子的關(guān)鍵結(jié)合位點。