人源性D-二聚體及其抗體cDNA制備研究.pdf

1、目的：
　　 為彌補(bǔ)用單克隆抗體制備D-二聚體抗體方法的不足，尋找高特異性D-二聚體抗原決定簇，本課題通過(guò)制備人源性D-二聚體粗品用來(lái)免疫小鼠，獲得其抗體cDNA，為下一步D-二聚體噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩庫(kù)打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 采用凍融法從新鮮人血漿中提取纖維蛋白原。將人纖維蛋白原溶液與正常人新鮮血漿(提供制備交聯(lián)纖維蛋白的凝血酶與ⅩⅢ因子)混合并加入咪唑緩沖液(IBS)制備得人交聯(lián)纖維蛋白，再經(jīng)人纖維

2、蛋白溶解酶水解。產(chǎn)物通過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠(sephadex)G-150凝膠過(guò)濾制備獲得D-二聚體的粗品。經(jīng)過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白純度后，加入等體積完全福氏佐劑用于免疫BALB/C小鼠。再每隔一周用D-二聚體的粗品與等體積的福氏不完全佐劑混合加強(qiáng)免疫共3次后取脾、低溫碾磨、勻漿，提取脾臟細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用凍融法從新鮮人血漿中提取的纖維蛋白原沉

3、淀，經(jīng)咪唑緩沖液溶解后加入新鮮人血漿，37℃水浴10分鐘纖維蛋白原完全凝固成白色膠體狀。經(jīng)尿素溶解實(shí)驗(yàn)確定為交聯(lián)纖維蛋白膠體。
　　 2.將交聯(lián)纖維蛋白膠體置于pH7.6的TBS緩沖液中，加入纖維蛋白溶解酶。經(jīng)過(guò)37℃搖床水解48小時(shí)，交聯(lián)纖維蛋白膠體基本完全降解為可溶性降解產(chǎn)物。溶液經(jīng)冷干78小時(shí)后轉(zhuǎn)為微黃色完全溶解液體。
　　 3.獲取的液體經(jīng)非還原性SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色顯色后顯示出幾條清晰

4、的條帶。按照蛋白質(zhì)Marker的分子量對(duì)照，可以認(rèn)為獲取液所含大部分蛋白質(zhì)約為190KDa。與D-二聚體的分子量大小一致，說(shuō)明酶解條件合適。
　　 4.獲取液再以每小時(shí)10ml的速度，用pH7.6的TBS緩沖液平衡，上樣，凝膠過(guò)濾。每10分鐘獲取一次濾過(guò)液，收集完后透析，去鹽，再進(jìn)行SDS-PAGE，顯示經(jīng)β-巰基乙醇還原后出現(xiàn)90、80KDa的蛋白質(zhì)碎片，應(yīng)為D-二聚體的D碎片及β-鏈。
　　 5.取得的D-二聚體粗品

5、經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌免疫小鼠，四周后提取小鼠脾臟細(xì)胞總RNA。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取的總RNA三條帶兩條清晰可見，符合逆轉(zhuǎn)錄為cDNA的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)論：
　　 本課題從新鮮人血漿中提取纖維蛋白原，制備形成人交聯(lián)纖維蛋白膠體，通過(guò)蛋白酶降解、凝膠過(guò)濾后分離提純、免疫小鼠提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。后期課題可運(yùn)用RT-PCR技術(shù)獲得抗D-二聚體抗體可變區(qū)VL、VH的基因，構(gòu)建噬菌體D-二聚體抗體文庫(kù)。本實(shí)驗(yàn)成