免疫法檢測D-二聚體的研究.pdf

1、D-二聚體是交朕纖維蛋白特異的降解產(chǎn)物，它的生成或增高反映了血漿中凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的激活，是唯一反映凝血和纖溶的理想指標(biāo)，在臨床上已視為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進的分子標(biāo)志物。D-二聚體的定量檢測可定量反映藥物的溶栓效果，及可用于診斷、篩選新形成的血栓。血漿D-二聚體抗原的測定方法主要有膠乳凝集法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法、光電散射比濁法和膠體金免疫滲透法（GIA），但是到目前為止，商品的D-二聚體檢測手段都尚存在一定局限性。膠體金標(biāo)

2、記技術(shù)和免疫熒光技術(shù)是近些年來發(fā)展迅速的檢測技術(shù)，具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點。因此，本研究擬開發(fā)用膠體金和熒光染料為標(biāo)記物的D-二聚體檢測試劑盒，并考察試劑盒對實際樣品的檢測性能。
　　 首先，選用樣品紙、吸收紙、硝酸纖維素膜（NC膜）及被襯摯組裝成試紙條。NC膜上分別固定D-Dimer抗體A1和兔抗鼠IgG抗體，作為檢測線和控制線，濃度均為2.2 mg·mL-1。若樣品中含有待測抗原則與標(biāo)記物包被的抗體結(jié)合，形成抗原-標(biāo)記

3、抗體復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物移動到檢測線時，檢測線上固定的D-Dimer抗體與樣品中的抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體交聯(lián)物。其余的標(biāo)記抗體繼續(xù)移動到質(zhì)控線與質(zhì)控抗體結(jié)合。由于檢測線上的小分子蛋白交聯(lián)物與質(zhì)控線上的抗體在硝酸纖維素膜都是固定的，結(jié)合在兩處的膠體金或熒光素就會顯現(xiàn)一定的顏色或熒光。
　　 其次，采用檸檬酸三鈉法制備膠體金，根據(jù)顏色、波長掃描曲線，選擇粒徑為18 nm的膠體金顆粒標(biāo)記抗體，即100 mL氯金

4、酸溶液（0.01％）中需加入還原劑檸檬酸三鈉（1％）的量為6 mL。通過實驗，膠體金標(biāo)記D-Dimer抗體的pH為7.4，每毫升最佳包被量為25.6μg。本實驗測定了膠體金法與生化分析儀的比對試驗，回歸方程為y=-0.119+1.045c，相關(guān)系數(shù)r=0.993。用膠體金法測定了靈敏度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、生物性物質(zhì)干擾等性能。結(jié)果顯示，該膠體金法制備的試劑盒靈敏度高（0.473μg·mL-1），并有良好的重復(fù)性（STDEV=0.093～0

5、.115）和抗干擾性，4℃條件下可以保存很長時間。
　　 最后，用熒光染料Cy5對DD2抗體進行包被，包被完的蛋白在PBS緩沖液（pH7.2，10 mM）中透析24小時，以除去多余的熒光染料。熒光染料-抗體蛋白稀釋至500倍時有良好的檢測效果，此時可以降低背景信號，還可避免熒光猝滅的發(fā)生。本實驗測定了熒光素法與生化分析儀的比對試驗，回歸方程為y=0.00984+0.1962c，相關(guān)系數(shù)r=0.975。用熒光素法測定了靈敏度、重復(fù)