BMP2-7異源二聚體與全反式維甲酸在體外細胞成骨中的作用.pdf

1、骨缺損在臨床上十分普遍，而由先天骨發(fā)育不良或發(fā)育畸形以及腫瘤、炎癥、外傷等原因造成的大面積以及極限骨缺損仍是正頜外科、口腔頜面外科以及口腔種植科醫(yī)生所面臨的嚴峻挑戰(zhàn)之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一組具有高度保守結構的二聚體蛋白，屬于轉移生長因子(TGF-)超家族成員，在促進骨再生研究的領域中是主要的細胞因子之一。尤其是BMP2同源二聚體和BMP7同源二聚體，先后得到FDA認證，可用于脊椎融合術、修復骨缺損、加速骨聯(lián)合等方面的輔助治療。

2、BMP2/7異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導成骨作用，其誘導的細胞ALP活性以及體內成骨量是相應BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調控破骨細胞分化，刺激破骨細胞的活性，促進成熟破骨細胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP2/7能在顯著較低的濃度起效誘導細胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內達到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內所達到的作用效果峰值;并且BMP2/7

3、在誘導細胞破骨發(fā)生過程中并不存在這一特點，即在低濃度范圍內促進破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應。近期的動物實驗建立小型豬顱頂骨的極限種植體周圍骨缺損模型，通過micro-CT的掃描檢測和新生骨小梁的數(shù)量、厚度、距離以及新骨結構模型等參數(shù)分析，BMP2/7誘導的新生骨組織量顯著多于BMP2和BMP7組，并且BMP2/7誘導的新生骨組織結構最接近于缺損周邊正常骨組織。
　　此外，有文獻報道全反式維甲酸(all-tra

4、ns retinoic acid，ATRA)能夠上調多種細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞、干細胞等的成骨相關基因的表達，促進基質礦化。同時，也有研究報道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應用能夠協(xié)同誘導脂肪源細胞的成骨分化，促進顱骨成骨細胞和軟骨細胞的成骨分化，以及通過細胞介導的組織工程學技術促進體內的成骨細胞募集和骨組織改建更新。但亦有報道指出ATRA和BMP協(xié)同抑制細胞成骨分化并促進細胞成脂分化。故本實驗著重研究ATRA與低劑量

5、BMP2/7對不同種類細胞成骨分化的影響，及二者聯(lián)合應用能否對細胞成骨分化產生協(xié)同促進作用，進一步有效促進成骨分化和新骨形成。
　　第一部分:BMP2/7異源二聚體與全反式維甲酸對小鼠原成骨細胞MC3T3-E1的作用
　　目的:
　　BMP2/7異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導成骨作用，其誘導的細胞ALP活性以及體內成骨量是相應BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用

6、，刺激和調控破骨細胞分化，刺激破骨細胞的活性，促進成熟破骨細胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP2/7能在顯著較低的濃度起效誘導細胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內達到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內所達到的作用效果峰值;并且BMP2/7在誘導細胞破骨發(fā)生過程中并不存在這一特點，即在低濃度范圍內促進破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)能

7、夠上調多種細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞、干細胞等的成骨相關基因的表達，促進基質礦化。同時，也有研究報道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應用能夠協(xié)同誘導脂肪源細胞的成骨分化，促進顱骨成骨細胞和軟骨細胞的成骨分化，以及通過細胞介導的組織工程學技術促進體內的成骨細胞募集和骨組織改建更新。但亦有報道指出ATRA和BMP協(xié)同抑制細胞成骨分化并促進細胞成脂分化。本研究旨在探討rhBMP2/7異源二聚體和ATRA分別對小鼠原成骨細胞MC3T

8、3-E1的作用，二者之間是否存在協(xié)同誘導小鼠原成骨細胞MC3T3-E1成骨的作用及其體外誘導成骨發(fā)生的具體生物學功能特點。
　　材料和方法:
　　以不同濃度的rhBMP2/7異源二聚體(5ng/ml，50ng/ml)及ATRA（1uM）作用于小鼠原成骨細胞MC3T3-E1，并設立對照組，檢測rhBMP2/7和ATRA及二者聯(lián)合應用在誘導成骨前體細胞MC3T3-E1成骨發(fā)生過程中的作用，檢測成骨發(fā)生各階段的相關指標。用熒光定量

9、法檢測細胞增殖后的細胞個數(shù);用比色法檢測細胞成骨分化早期指標堿性磷酸酶(ALP)活性;用ELISA方法檢測成骨分化晚期指標細胞骨鈣素(OCN)的分泌量;用RT-PCR法檢測細胞成骨相關基因(ALP、OCN、Col1、Runx2)的表達水平;用茜素紅染色觀察并計量細胞礦化誘導培養(yǎng)后的細胞外基質礦化結節(jié)面積及吸光度。
　　結果:
　　細胞因子刺激培養(yǎng)1天時，僅單純50ng/ml BMP2/7組細胞數(shù)明顯增加，而其他5組并未發(fā)現(xiàn)明

10、顯的抑制或促進細胞增殖的作用。第4天時，單純ATRA對細胞增殖具有抑制作用，但ATRA對細胞增殖的這種抑制作用，可以通過添加5ng/ml或50ng/ml BMP2/7予以補償。而5ng/ml或50ng/ml BMP2/7單獨作用下，細胞增殖均較其他組顯著。但ATRA未明顯影響細胞ALP活性，無論是否添加ATRA，BMP2/7在任一時間點均可明顯促進細胞ALP活性表達，并且具有濃度依賴性。ATRA對細胞OCN表達的影響較其對細胞增殖的影響

11、相似，在第4天和第7天ATRA均能明顯抑制細胞OCN表達，第4天時，5ng/ml BMP2/7即可完全拮抗ATRA對OCN表達所產生的抑制作用，使而二者聯(lián)合應用時OCN表達水平與空白對照組OCN表達水平相近。然而在第7天時，其對ATRA所產生的拮抗作用有所減弱?？傊珹TRA在任一時間點均可抑制BMP2/7引起的OCN的表達。茜素紅染色結果顯示，1uM ATRA可以明顯抑制細胞外基質礦化。5ng/ml BMP2/7+ATRA組細胞外基質

12、礦化面積明顯低于空白對照組，而50ng/ml BMP2/7則可完全拮抗ATRA對細胞外基質礦化所產生的的抑制作用，二者聯(lián)合應用時細胞外基質礦化面積約為空白對照組的2.5倍。單純50ng/ml BMP2/7作用下細胞外基質礦化最為明顯。基因研究結果顯示在第一天，無論是否添加BMP2/7，ATRA均顯著抑制Runx2基因的表達。然而，單純ATRA則可在第4天和第7天時明顯促進Runx2的基因表達。BMP2/7對Runx2基因表達的促進作用則

13、表現(xiàn)為濃度依賴型。任一時間點時，ATRA均可明顯抑制Ⅰ型膠原基因的表達，而5ng/ml BMP2/7在任一時間均可完全拮抗由ATRA產生的這種對Ⅰ型膠原基因表達的抑制作用。50ng/ml BMP2/7在第一天和第7天時亦可產生與5ng/ml BMP2/7相同的作用，并且在第四天時50ng/ml BMP2/7可明顯促進Ⅰ型膠原基因的表達。與ALP活性表達不同的是，ATRA在任一時間點均抑制ALP基因的表達。5ng/ml和50ng/ml B

14、MP2/7均能拮抗ATRA對細胞ALP基因所產生的抑制作用，并促進細胞ALP基因的表達。單純BMP2/7對細胞OCN基因表達水平則具有明顯促進作用，且具有一定的濃度依賴性，但在第4天和第7天ATRA均能明顯抑制BMP2/7所誘導的OCN基因表達。任一時間點，單純ATRA均可明顯抑制OCN基因表達，5ng/ml BMP2/7即可完全拮抗由ATRA所產生的抑制作用，而50ng/ml BMP2/7不僅可以完全拮抗ATRA所產生的拮抗作用，而且

15、可明顯促進細胞OCN基因的表達。無論是否添加ATRA，BMP2/7對細胞OCN基因表達的促進作用均呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。而第4天和第7天時，ATRA均能明顯抑制由5或50ng/ml BMP2/7所引起的OCN基因的表達。
　　結論:
　　ATRA抑制小鼠原成骨細胞MC3T3-E1的成骨分化，BMP2/7促進小鼠原成骨細胞MC3T3-E1的成骨分化，并呈現(xiàn)濃度依賴性;ATRA與BMP2/7間并不存在協(xié)同誘導小鼠原成骨細胞MC3

16、T3-E1成骨分化的作用，而BMP2/7可拮抗ATRA對細胞成骨分化所產生的抑制作用并明顯促進細胞成骨分化。
　　第二部分:BMP2/7異源二聚體與全反式維甲酸對SD大鼠BMSC成骨分化的作用
　　目的:
　　BMP2/7異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導成骨作用，其誘導的細胞ALP活性以及體內成骨量是相應BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調控破骨細胞分化

17、，刺激破骨細胞的活性，促進成熟破骨細胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP2/7能在顯著較低的濃度起效誘導細胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內達到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內所達到的作用效果峰值;并且BMP2/7在誘導細胞破骨發(fā)生過程中并不存在這一特點，即在低濃度范圍內促進破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)能夠上調多種細胞，包括成骨

18、細胞、成纖維細胞、骨髓基質細胞、干細胞等的成骨相關基因的表達，促進基質礦化。同時，也有研究報道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應用能夠協(xié)同誘導脂肪源細胞的成骨分化，促進顱骨成骨細胞和軟骨細胞的成骨分化，以及通過細胞介導的組織工程學技術促進體內的成骨細胞募集和骨組織改建更新。本研究旨在探討rhBMP2/7異源二聚體和ATRA誘導大鼠原代BMSC成骨分化的作用，二者之間是否存在協(xié)同誘導小大鼠原代BMSC成骨分化作用及其體外誘導成骨發(fā)生的具體生物學

19、功能特點。
　　材料和方法:
　　獲取SD大鼠脛骨及股骨原代BMSCs，流失細胞儀鑒定細胞純度后以不同濃度的rhBMP2/7異源二聚體(5ng/ml，50ng/ml)及ATRA（1uM）作用于大鼠原代BMSC成骨分化，并設立對照組，檢測rhBMP2/7和ATRA及二者聯(lián)合應用在誘導大鼠原代BMSC成骨發(fā)生過程中的作用，檢測成骨發(fā)生各階段的相關指標。用熒光定量法檢測細胞增殖后的各組DNA含量;用比色法檢測細胞成骨分化早期指標堿

20、性磷酸酶(ALP)活性;用ELISA方法檢測成骨分化晚期指標細胞骨鈣素(OCN)的分泌量;用實時熒光定量RT-PCR法檢測細胞成骨相關基因（ALP、OCN、Runx2）的表達水平;用茜素紅染色觀察并計量細胞礦化誘導培養(yǎng)后的細胞外基質礦化結節(jié)面積。
　　結果:
　　單純ATRA作用下，細胞增殖明顯被抑制，第七天DNA含量僅較第四天略有提升，而BMP2/7可以對抗ATRA對細胞增殖產生的抑制作用，在第四天，ATRA聯(lián)合應用5ng

21、/ml及50ng/ml的BMP2/7較單獨應用ATRA，均可以明顯促進細胞增殖，而在第七天時，與單獨應用ATRA相比，ATRA與50ng/ml BMP2/7聯(lián)合應用亦使DNA含量明顯增高。不同于ATRA和BMP2/7對細胞增殖的影響，ATRA.和BMP2/7均能明顯促進BMSC在第四天及第七天ALP活性表達。任一時間點，ATRA與BMP2/7(5ng/ml，50ng/ml)聯(lián)合作用下，均可明顯促進細胞ALP的活性表達。第七天，ATRA與

22、50ng/ml協(xié)同促進BMSC ALP活性表達水平則達到空白組ALP活性表達水平的7.01倍。BMP2/7對細胞OCN水平具有促進作用，并隨BMP2/7濃度的增加而增加。然而，任一時間點，單純ATRA作用時明顯抑制了OCN的表達。在ATRA作用下，BMP2/7對OCN表達水平的作用則表現(xiàn)為濃度和時間依賴性。細胞因子刺激培養(yǎng)14天后，僅BMP2/750ng/ml組出現(xiàn)基質礦化，細胞因子刺激培養(yǎng)21天后，空白對照組及單純ATRA作用組僅可檢

23、測到極少量的鈣鹽沉積，可見單純ATRA對BMSC細胞礦化僅有極小的影響。BMP2/7含或不合ATRA均能明顯促進細胞基質礦化，并且細胞外基質礦化面積隨BMP2/7濃度的增加而增加。ATRA明顯下調5ng/ml BMP2/7所誘導的細胞外基質礦化，但這種抑制作用在50ng/ml BMP2/7時則并不存在。單純5ng/ml BMP2/7或者ATRA刺激培養(yǎng)7天后才能明顯促進Runx2基因的表達。50ng/ml BMP2/7在細胞因子刺激培養(yǎng)

24、4天和7天時均能明顯促進Runx2基因的表達，與單純ATRA組及5ng/ml BMP2/7+ATRA組相比，50ng/ml BMP2/7+ATRA組則明顯促進Runx2基因的表達。與ALP活性表達不同的是，在第4天時，ATRA并沒有明顯影響ALP基因的表達，在第7天時，ATRA對ALP基因的表達表現(xiàn)出明顯的抑制作用。單純5ng/ml BMP2/7和50ng/ml BMP2/7則在細胞因子刺激培養(yǎng)第7天時表現(xiàn)為促進作用。細胞因子刺激培養(yǎng)第

25、4天時，與空白對照組相比，ATRA和任一濃度的BMP2/7共同作用均能明顯促進ALP基因的表達。與第4天相比，ATRA和50ng/ml BMP2/7在第7天時明顯促進細胞ALP基因表達。細胞因子刺激培養(yǎng)7天時，空白對照組及單純BMP2/7作用組的細胞OCN基因表達水平較4天時明顯上升，在第7天時，任何BMP2/7濃度(0ng/ml，5ng/ml，50ng/ml)下ATRA均能明顯抑制細胞OCN基因表達水平，而這種抑制現(xiàn)在在細胞因子刺激培

26、養(yǎng)4天時并未出現(xiàn)。
　　結論:
　　BMP2/7促進SD大鼠BMSCs成骨分化，并呈現(xiàn)濃度依賴性。BMP2/7和ATRA協(xié)同誘導SD大鼠BMSCs成骨早期分化，促進ALP活性表達，但ATRA抑制BMSC中晚期成骨分化，抑制細胞外基質礦化，而BMP2/7促進BMSC成骨分化，促進細胞外基質礦化，并呈濃度依賴性，ATRA可抑制低濃度BMP2/7誘導細胞成骨分化的能力，而相對高濃度BMP2/7誘導細胞成骨分化的能力不受ATRA影響