靶向異二聚體型核受體的藥物發(fā)現(xiàn)研究.pdf

1、發(fā)現(xiàn)和確證新的藥物作用靶點(diǎn)是藥學(xué)研究的重要內(nèi)容。核受體是一類配體依賴性激活的轉(zhuǎn)錄因子超家族，其在生長發(fā)育、新陳代謝、細(xì)胞分化和凋亡、免疫應(yīng)答等人體許多重要生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中，異二聚體型核受體(heterodimernuclear receptors，HD-NRs)為核受體超家族中的主要成員。 維甲酸受體(Retinoid A receptor)、肝X受體(Live X receptor，LXRs)、法尼醇X受體(fam

2、esoid X receptor,FXR)均屬于異二聚體型核受體亞家族，其參與調(diào)控體內(nèi)的維甲類物質(zhì)以及糖，脂質(zhì)，膽固醇、膽酸代謝，在機(jī)體的代謝平衡中起關(guān)鍵的作用。它們與RXR形成二聚體后，通過與特異響應(yīng)元件結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。心腦血管疾病、2型糖尿病、肥胖、骨質(zhì)疏松、皮膚病，炎癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等的發(fā)生均與其功能和調(diào)控異常有關(guān)。因此這類核受體可作為治療代謝紊亂性疾病的新靶點(diǎn)。 本論文研究的主要內(nèi)容為將異二聚體型核受體作為藥

3、物新靶點(diǎn)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)拇_證和評價(jià)，并利用新的藥物篩選技術(shù)，建立高通量藥物篩選平臺，篩選發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物。本論文主要從以下幾個方面開展研究： 一．維甲酸受體高內(nèi)涵篩選體系的構(gòu)建與應(yīng)用作為經(jīng)典的異二聚體型核受體，維甲酸受體經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)與癌癥和皮肽病等多種疾病密切相關(guān)，其激動劑已成功用于這類疾病的防治。然而，傳統(tǒng)的維甲酸受體激動劑，如全反式維甲酸仍具有一定的毒副作用。尋找高效、低毒、特異的小分子維甲類藥物仍是目前研究的熱點(diǎn)。本論文成功建

4、立了一個穩(wěn)定、靈敏、重復(fù)性好的維甲酸受體激動劑高內(nèi)涵篩選體系，并結(jié)合虛擬篩選，從20,000個化合物中篩選得到了活性化合物7672和7666，并對7672進(jìn)行了進(jìn)一步的活性評價(jià)。 二．基于細(xì)胞的HD-NR激動劑高通量篩選和評價(jià)體系的建立和應(yīng)用哺乳動物細(xì)胞單雜交技術(shù)是近些年發(fā)展起來，主要應(yīng)用于核受體功能及其配體生理活性篩選和評價(jià)的新技術(shù)。該機(jī)理利用了核受體的分子結(jié)構(gòu)中共有的兩個主要結(jié)構(gòu)域：配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域

5、(DBD)，以及酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GAL4具有核受體相似結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。將核受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)與酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合成嵌合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，再與含有GAL4特異的響應(yīng)元件的報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，通過測定報(bào)告基因的表達(dá)水平從而評價(jià)核受體配體的激動或拮抗活性。另外，因?yàn)椴溉閯游锛?xì)胞沒有酵母的GAL4，所以不存在內(nèi)源性核受體的之間的相互干擾和交叉效應(yīng)，這也是該技術(shù)用于篩選和評價(jià)配體活性的最大優(yōu)點(diǎn)。 為了

6、研究和開發(fā)新的預(yù)防和治療代謝紊亂性疾病的候選藥物，以及進(jìn)行相關(guān)機(jī)理研究，建立了基于哺乳動物細(xì)胞單雜新技術(shù)的異二聚體型核受體LXRα和FXR的高通量激動劑的篩選及活性評價(jià)體系。 首先利用RT-PCR技術(shù)從肝組織的總RNA中擴(kuò)增LXRα和FXR的配體結(jié)合域(LBD)基因片斷，并將其與酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合域連接構(gòu)建融合表達(dá)載體pBIND-LXRR(α-LBD，pBlND-FXR-LBD：而采用的報(bào)告質(zhì)粒pG5是由人工合成5

7、xGAL4的相應(yīng)元件，插入報(bào)告基因上游構(gòu)建而成。 通過優(yōu)化多種轉(zhuǎn)染條件，確定了最佳的共轉(zhuǎn)染條件。利用陽性藥對細(xì)胞水平的FXR，LXR激動劑篩選模型進(jìn)行了驗(yàn)證。陽性藥在各自的模型中都呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系和很高的信噪比，而且用于評價(jià)模型穩(wěn)定性的參數(shù)z’因子均在0.5-0.7之間，從而證明了所建立的模型具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。 經(jīng)過篩選，從植物來源的純化合物庫中篩選得到了4個活性化合物，為特異的LXR激動劑，其對FXR有弱的激

8、活作用。通過進(jìn)一步的載體改構(gòu)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染，基于哺乳動物單雜交技術(shù)原理，對新的HCS篩選體系的建立進(jìn)行了初步摸索。 三．化合物對核受體調(diào)控作用對體外高通量篩選方法的建立和應(yīng)用本研究成功建立了基于熒光偏振的評價(jià)配體結(jié)合LXR或FXR，募集共激活子能力的評價(jià)方法，其基本原理為當(dāng)核受體與配體結(jié)合后，核受體構(gòu)象會發(fā)生改變，從而促進(jìn)了受體與共激活子的結(jié)合。利用核受體LBD及共激活子的LXXLL基序結(jié)合并采用熒光偏振的方法來篩選核受體的配體，該

9、方法適用適用于所有代謝性異二聚體型核受體，包括RAR、CAR、VDR、PPAR、LXR和FXR等。 通過體外的FP體系評價(jià)，4個活性化合物不僅在細(xì)胞水平可激活LXR，還可以直接與LXR結(jié)合，并募集共激活子，為LXR的激動劑。 體外和細(xì)胞水平篩選平臺的建立不僅可以在藥物發(fā)現(xiàn)的早期確證核受體先導(dǎo)化合物，發(fā)現(xiàn)用于調(diào)控與代謝相關(guān)的基因而治療代謝性疾病的藥物，而且為受體生理機(jī)制的闡明提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 四、肝X受體活性化合

10、物活性評價(jià)和抗動脈粥樣硬化(AS)藥理活性研究本論文首次發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇四聚體的LXR激動活性，并首次揭示了其通過LXR通路在抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮作用的機(jī)制。 首先研究了化合物在HDL代謝和膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，發(fā)現(xiàn)化合物通過上調(diào)LXR的靶基因，可抑制泡沫化細(xì)胞的形成和促進(jìn)脂裝載的巨噬細(xì)胞中膽固醇的外排。 化合物還具有抗炎活性，其可降低炎性因子的表達(dá)并抑制單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。 化合物還可增加超氧化物歧化酶的