YopJ的絲氨酸和賴氨酸雙乙?；钚约肮δ?pdf

1、本研究通過模擬耶氏鼠疫桿菌感染過程揭示細菌性乙酰轉移酶YopJ對絲氨酸乙酰化與賴氨酸乙?；募毎麑W效應。應用鳥槍蛋白組學方法和label-free定量技術，我們比較了YopJ對細胞蛋白上的絲氨酸與賴氨酸殘基乙?；挠绊?。特別是我們鑒定出了膜相關泛素連接酶MARCH8上的絲氨酸與賴氨酸乙?；稽c并制備了針對MARCH8絲氨酸乙?；稽c的抗體，用免疫學方法證實了YopJ對March8絲氨酸和賴氨酸乙酰化的影響。YopJ催化區(qū)突變體的研究表明

2、YopJ誘導的絲氨酸和賴氨酸乙?；谴呋瘏^(qū)依賴的，催化區(qū)突變體不能有效誘導絲氨酸和賴氨酸乙?；?。我們的結果表明絲氨酸乙?；竃opJ可以靶向其蛋白底物雙乙酰化賴氨酸和絲氨酸殘基。
　　研究目的:
　　證實YopJ對絲氨酸和賴氨酸殘基雙乙?；钚耘c功能
　　研究方法:
　　1、重組質粒的構建與在HeLa中的表達:YopJ cDNA是全基因合成的，MARCH8 cDNA是通過RT-PCR方法從K562細胞中擴增出來的

3、。MARCH8截斷體是1-156aa，全長是1-291aa。cDNAs被亞克隆到pcDNA3.0-flag載體中，它們的序列都經(jīng)過測序驗證。YopJ催化區(qū)突變體C172A是通過定點突變從YopJ重組質粒中擴增而來并經(jīng)過測序驗證。重組質粒經(jīng)過Omega大抽質粒盒子純化后用Lipofectamine轉染到HeLa細胞中，轉染24-48h后收集細胞提取蛋白。
　　2、蛋白提取:收集細胞用PBS洗三遍后，用Millipore RIPA裂解

4、液裂解，通過超聲或冰上裂解法獲取蛋白。
　　3、溶液內酶解:在一個過濾膜(Microcon YM-30)上，加入50μg的蛋白樣品，200μ l含8M尿素的1M Tris-HCl中，離心，用50 mM的碳酸氫銨洗兩次，用含1μg胰酶的50 mM碳酸氫銨重懸，輕輕旋轉混勻，37℃酶解24h，用C18Ziptip脫鹽后，凍干貯存于-80℃?zhèn)溆谩?br>　　4、免疫沉淀和膠內酶解:轉染MARCH8和（或）YopJ的HeLa細胞，常規(guī)方法

5、制得細胞抽提物，用Flag抗體免疫沉淀帶Flag標簽的MARCH8，用SDS-PAGE膠分離，手術刀片切下MARCH8條帶，標準方法進行膠內酶解24h，過zip-tip脫鹽后，LC-MS/MS分析。
　　5、LC-MS/MS分析:取約2μg的肽段注射到C18柱中（200xφ0.075mm），用120 min的線性梯度（5-35％乙腈，0.1％的甲酸水）洗脫，然后用Orbitrap Elite質譜儀檢測。數(shù)據(jù)的采集采用數(shù)據(jù)依賴模式，

6、所有掃描的一級質譜中前20個最強的峰進行二級質譜測定。MS/MS二級質譜用Mascot和Sequest搜索人蛋白數(shù)據(jù)庫(UniProtKB，88295 entries)，分析軟件是Proteome Discoverer1.4(Thermo Scientific，San Jose，CA).MS/MS質譜圖搜庫的容差是0.8 Da，10 ppm，動態(tài)修飾是賴氨酸、絲氨酸乙?；琢虬彼嵫趸?。所有修飾位點的確認需要經(jīng)過人工檢索圖譜確定。

7、>　　6、Label-free定量:Label-free方法測量肽段的豐度是由Progenesis LC-MSsoftware(version4.1; Nonlinear Dynamics，UK)完成的。簡言之，質譜獲得的Raw文件用ReAdw-program程序轉換成mzxml格式，并輸入到ProgenesisLC-MS軟件中。多個分析并行時，離子強度圖可用來診斷檢測的缺陷。最好的數(shù)據(jù)集被選作數(shù)據(jù)校準的參照。排除電荷數(shù)為1或＞4的肽段

8、。同時搜一個反庫(decoy database)來確定出錯率(FDR)。每個通過質譜確定的有效肽段的定量定義為該位點的所有肽段豐度之和。統(tǒng)計學分析根據(jù)某一位點所有乙?；亩呜S度之和與未修飾肽段之和的比值。溶液內酶解的數(shù)據(jù)，有時找不到對應的非乙?；亩危筒捎媚骋晃稽c所有乙?；亩呜S度之和與一套α-actin的參考肽段豐度之和的比值.
　　7、MARCH8 Sac71多克隆抗體的制備:化學合成March8乙?；亩蜸ac71，Ac-

9、T(Sac) ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2及相應的未修飾肽段 S71，Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2，并經(jīng)質譜驗證純度在90％以上。乙?；亩闻cBSA偶聯(lián)后，免疫新西蘭大白兔三次，末次免疫10天后采血用ELISA法測抗體滴度，末次注射15天后采取所有的血樣收集抗血清。抗血清過兩次與未修飾肽段偶聯(lián)的色譜柱去除與未修飾肽段結合部分，再過一次與修飾肽段偶聯(lián)的色譜柱,收集與修飾肽段結合的成分。抗體的特異性

10、經(jīng)過Dot-blot和競爭實驗驗證。
　　8、免疫沉淀-WB:帶Flag標簽的MARCH8用Flag抗體進行免疫沉淀，沉淀得到的蛋白用SDS-PAGE電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜上，用5％ BSA封閉。一抗用anti-flag、泛賴氨酸乙酰化抗體、MARCH8 Sac71抗體檢測。二抗是熒光標記的IRDye800CW或IRDye680CW conjugated IgG，結果用LI-COR遠紅外成像系統(tǒng)掃描。
　　9、體外乙酰

11、化實驗（用YopJ重組細胞抽提物）:轉染有MARCH8的HeLa細胞抽提物用Flag抗體進行IP，將MARCH8固定在瓊脂糖珠子上，進行體外乙?；磻５谝环菖c空載對照pcDNA3.0-flag的細胞抽提物孵育，第二份與轉染YopJ的HeLa細胞抽提物孵育，第三份與轉染YopJ突變體C172A的HeLa細胞抽提物孵育。所有體系中都添加乙酰輔酶A，蛋白酶抑制劑，去乙酰化酶抑制劑，在37℃孵育1h，孵育結束后，洗滌，用western-blo

12、t分析結果。一抗為anti-flag、泛賴氨酸乙?；贵w(Pan-K)、MARCH8 Sac71抗體。
　　研究結果:
　　1、乙酰轉移酶YopJ介導了HeLa細胞蛋白絲氨酸和賴氨酸殘基的雙乙?；?用鳥槍蛋白組學和Label-free定量，我們證明YopJ的轉染可以引起細胞蛋白絲氨酸和賴氨酸乙?；奶岣撸渲邪?0個絲氨酸乙?；稽c(YopJ/non-YopJ1.3-fold，p=0.02)和8個賴氨酸乙?；稽c(YopJ

13、/non-YopJ3.5-fold，p=0.00003)。
　　2、絲氨酸乙酰化酶YopJ可以雙乙?；疎3泛素連接酶MARCH8的絲氨酸和賴氨酸殘基:用免疫沉淀和LC-MS/MS證明，YopJ的轉染可以雙乙?；疢ARCH8的S44，S71，S253位點以及K247，K252位點。label-free定量表明YopJ轉染的HeLa細胞中Sac253和Sac44分別提高了28±11(p=0.002)和31±8(p=0.002)倍，Ka

14、c252和Kac247分別提高了36±18(p=0.0003)和18±8(p=0.01)倍。
　　3、體內外免疫實驗均證明乙酰化酶YopJ可以雙乙?；疢ARCH8的絲氨酸和賴氨酸殘基:為證實YopJ對MARCH8的雙乙?；饔?，我們制備了MARCH8 Sac71特異性抗體，Dot-blot和競爭實驗均證明該抗體是針對Sac71的特異性抗體。IP-WB證實YopJ與MARCH8共轉HeLa細胞之后，MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙?；?/p>

15、水平都得到明顯提高，絲氨酸乙?；岣吡?.8倍(1.8±0.5，p=0.027，n=3)，賴氨酸乙?；岣吡?.9倍(1.9±0.4，p=0.012，n=3)，證明MARCH8中可以在體內提高絲氨酸和賴氨酸乙?；?。與此一致的是，共轉YopJ的催化區(qū)突變體C172A與MARCH8，MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙?；讲⑽吹玫较鄳奶岣?，說明YopJ的雙乙?；饔檬谴呋瘏^(qū)依賴的。為進一步證明YopJ是直接乙酰化了MARCH8的賴氨酸和

16、絲氨酸殘基，我們又進行了體外試驗，首先我們用免疫沉淀得到的MARCH8與轉染YopJ的HeLa細胞抽提物及乙酰輔酶A于37℃共同孵育1h，然后用MARCH8 Sac71和Pan-K乙?；贵w分別檢測MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙酰化水平，結果與空載對照相比，YopJ可以明顯提高MARCH8的絲氨酸和賴氨酸乙?；蕉渫蛔凅wC172A的這種能力明顯降低。為進一步排除YopJ細胞抽提物中其他因素的干擾，我們又用純化的YopJ進行了體外乙酰

17、化實驗，結果與用YopJ細胞抽提物得到的結果相似，充分證明了YopJ對MARCH8絲氨酸和賴氨酸殘基的雙乙酰化作用。
　　4、YopJ對MARCH8的雙乙?；岣吡薓ARCH8的自身泛素化水平且這種作用是催化區(qū)依賴的:為探討YopJ對MARCH8的雙乙?；募毎麑W或生物學功能，我們檢測了MARCH8的自身泛素化水平。結果表明，與YopJ共轉的MARCH8的體外自身泛素化水平比單轉MARCH8的明顯提高，YopJ突變體C172A提高

18、MARCH8自身泛素化水平的能力明顯降低，說明這一能力是催化區(qū)依賴的。
　　研究結論:
　　我們通過鳥槍蛋白組學和Label-free方法證明了絲氨酸乙?；竃opJ對細胞蛋白水平和靶蛋白MARCH8絲氨酸和賴氨酸殘基的雙乙?；?，并用免疫學方法用體內外實驗證明了YopJ對MARCH8的雙乙?；?，提示絲氨酸乙?；唾嚢彼嵋阴；g可能構成網(wǎng)絡。特別是，YopJ的雙乙?；瘏⑴c了MARCH8的自身泛素化過程，提示了MARCH8雙乙