病毒Tat蛋白乙?；{(diào)節(jié)機(jī)制及功能.pdf

1、蛋白的翻譯后修飾是很多真核生物蛋白功能調(diào)節(jié)的重要機(jī)制。與早前發(fā)現(xiàn)的磷酸化、泛素化等調(diào)節(jié)方式相類似，乙?；{(diào)節(jié)也是一種廣泛存在的翻譯后修飾手段。大約40年前，乙?；{(diào)節(jié)最早在組蛋白中被發(fā)現(xiàn)。乙酰化修飾與其他的修飾手段共同在以染色質(zhì)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳信息的構(gòu)建中起著至關(guān)重要的作用。除組蛋白外，在很多其他的核蛋白以及多種胞質(zhì)調(diào)節(jié)因子中也被報(bào)道存在乙酰化修飾。目前乙酰化已經(jīng)被證明參與超過80種轉(zhuǎn)錄因子和很多重要胞質(zhì)蛋白的功能調(diào)節(jié)。因此，

2、這種翻譯后調(diào)控不但對于細(xì)胞核內(nèi)蛋白的功能調(diào)控非常重要，而且對于調(diào)節(jié)包括細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)性、能量代謝、內(nèi)吞、自吞、以及細(xì)胞膜信號(hào)調(diào)控等在內(nèi)的多種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)過程也具有重要作用。
　　 轉(zhuǎn)錄激活蛋白Tat對于人類1型免疫缺陷病毒(HIV-1)的轉(zhuǎn)錄是必須的。與其他蛋白類似，Tat蛋白能進(jìn)行可逆的乙?；?，這對于它對HIV-1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活性至關(guān)重要。Tat蛋白有兩個(gè)已經(jīng)被確定的乙?；稽c(diǎn)，位于轉(zhuǎn)錄激活活性機(jī)構(gòu)域的28位賴氨酸和位于RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)

3、域的50位賴氨酸。Tat蛋白的28位賴氨酸能夠被p300/CBP-復(fù)合因子(PCAF)乙酰化，28位賴氨酸的乙酰化能夠通過增強(qiáng)Tat-CycTl-TAR復(fù)合體的親和力來促進(jìn)HIV-1轉(zhuǎn)錄延伸過程。但是目前為止，參與Tat蛋白28位賴氨酸去乙?；{(diào)節(jié)的酶仍不清楚。我們通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)鑒定出入類組蛋白去乙?；窱I家族成員HDAC6與Tat蛋白存在相互作用。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)Tat與HDAC6之間的相互作用需要微管的參與。體外去乙

4、酰化實(shí)驗(yàn)中，我們的結(jié)果顯示HDAC6能夠?qū)at蛋白28位賴氨酸進(jìn)行去乙?；?，并且這種作用也是微管依賴性的。我們通過螢火蟲酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測到.HDAC6能夠顯著影響Tat蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性。當(dāng)對細(xì)胞加入HDAC6特異性抑制劑tubacin處理或者轉(zhuǎn)染HDAC6siRNA對HDAC6的表達(dá)水平進(jìn)行下調(diào)時(shí)，Tat的轉(zhuǎn)錄激活活性會(huì)大幅上升。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，HDAC6可能是通過影響體內(nèi)CycTl與Tat蛋白間的相互結(jié)合而發(fā)揮對Tat轉(zhuǎn)

5、錄活性的抑制作用的。
　　 細(xì)胞凋亡既是機(jī)體維持細(xì)胞平衡的一個(gè)重要機(jī)制也是細(xì)胞抵御細(xì)菌和病毒入侵的一個(gè)重要手段。做為慢病毒家族的一個(gè)成員，HIV-1進(jìn)化出了一個(gè)強(qiáng)有力的通過啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制削弱宿主免疫抵抗力的感染策略。伴隨著HIV-1病毒的感染進(jìn)程，會(huì)出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞數(shù)量的大量減少，而細(xì)胞凋亡是造成細(xì)胞數(shù)量減少的主要機(jī)制。Tat蛋白可以被HIV-1病毒感染的宿主細(xì)胞所釋放，通過它的入膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)入周圍未被感染的細(xì)胞中。Tat蛋白的這

6、一特性使得它能在感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞中發(fā)揮多種生物學(xué)功能。Tat蛋白可以通過調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞因子的表達(dá)、激活細(xì)胞周期依賴性激酶、與細(xì)胞骨架蛋白相互作用等多種機(jī)制誘發(fā)細(xì)胞凋亡。特別需要指出的是，Tat蛋白可通過結(jié)合于微管或微管蛋白，促進(jìn)微管聚合，導(dǎo)致過度穩(wěn)定的微管的形成。微管的動(dòng)態(tài)性對于微管的很多胞內(nèi)功能至關(guān)重要，關(guān)于Tat結(jié)合微管如何導(dǎo)致微管聚合的分子機(jī)制仍然不清楚。已經(jīng)有證據(jù)證明翻譯后調(diào)控能夠調(diào)節(jié)一系列蛋白與微管的結(jié)合能力，因而我們猜想

7、Tat蛋白的乙?；部赡軙?huì)影響其與微管的相互作用。我們通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了一系列Tat蛋白突變體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們檢測到對Tat蛋白28位賴氨酸進(jìn)行突變能夠影響到Tat與微管間的相互作用。我們又利用體外合成的Tat小肽對體外聚合的微管進(jìn)行處理，通過微管蛋白渾濁度實(shí)驗(yàn)檢測Tat蛋白乙?；潭葘ξ⒐軇?dòng)態(tài)性的影響。通過實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Tat蛋白28位賴氨酸的乙?；潭却_實(shí)能夠顯著降低體外微管聚合的臨界濃度，并調(diào)節(jié)Tat蛋

8、白對微管穩(wěn)定性的影響。我們進(jìn)一步通過免疫熒光染色，流式細(xì)胞分析等技術(shù)檢測了Tat小肽處理細(xì)胞后，對細(xì)胞凋亡的影響。通過分析我們發(fā)現(xiàn)，Tat蛋白28位賴氨酸的乙酰化程度能夠調(diào)節(jié)Tat的細(xì)胞毒性，28位賴氨酸乙?；軌蛟鰪?qiáng)Tat蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果揭示乙?；揎棾四軐at蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行調(diào)節(jié)外，還能調(diào)節(jié)其與微管的相互作用，影響微管的動(dòng)態(tài)性，進(jìn)而影響Tat蛋白調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞凋亡的能力。這一結(jié)果為深入了解乙?；瘜Φ?/p>

9、白功能的影響開拓了新的視野。
　　 綜上所述，本研究首次鑒定出HDAC6是HIV-1 Tat28位賴氨酸的去乙酰化酶，HDAC6與Tat在體內(nèi)以微管依賴的方式相互作用，HDAC6通過對Tat進(jìn)行去乙?；瘉碚{(diào)節(jié)Tat的轉(zhuǎn)錄激活活性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Tat蛋白28位賴氨酸的乙?；潭炔粌H能夠影響Tat的轉(zhuǎn)錄激活活性，還能夠影響Tat與微管和微管蛋白間的相互作用，并對細(xì)胞內(nèi)微管的動(dòng)態(tài)性造成影響。28位賴氨酸的乙?；赡苁钦{(diào)節(jié)Tat蛋