蛋白激酶CDK8絲氨酸乙?；捌涔δ艿难芯?pdf

1、目的:通過對前期的質(zhì)譜檢測結(jié)果進(jìn)行搜庫、統(tǒng)計(jì)分析，首次在真核生物中發(fā)現(xiàn)了絲氨酸位點(diǎn)存在乙?；揎棳F(xiàn)象。而細(xì)胞周期依賴性激酶8(CDK8)是絲氨酸乙?；匾哪繕?biāo)蛋白之一。我們試圖通過本次試驗(yàn)確認(rèn)蛋白激酶CDK8絲氨酸位點(diǎn)存在乙?；揎?，并且進(jìn)一步探討蛋白激酶CDK8絲氨酸乙?；揎棇ζ淞姿峄掠蔚孜顲TD結(jié)構(gòu)域的影響。
　　方法:
　　1.根據(jù)Open Resarch結(jié)果，確認(rèn)真核細(xì)胞中內(nèi)源性蛋白激酶CDK8絲氨酸位點(diǎn)的乙酰

2、化:提取293T細(xì)胞總蛋白，IP純化內(nèi)源性CDK8，通過液-質(zhì)連用質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)檢測所有氨基酸位點(diǎn)乙?；揎椢稽c(diǎn)，了解蛋白激酶CDK8絲氨酸乙?；揎椩诠δ軈^(qū)的分布狀態(tài)及比例。
　　2.檢測外源性蛋白激酶CDK8在原核細(xì)菌中的絲氨酸的乙?；揎?構(gòu)建PQE30-His-CDK8重組質(zhì)粒，通過IPTG誘導(dǎo)劑使外源性CDK8質(zhì)粒在原核細(xì)菌BL21中表達(dá)，Ni柱純化外源性CDK8，LC-MS/MS技術(shù)檢測該蛋白絲氨酸乙?；?/p>

3、修飾情況。
　　3.檢測外源性蛋白激酶CDK8在真核細(xì)胞中的絲氨酸的乙?；揎?構(gòu)建PCDNA3.0-Flag-CDK8重組質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)把質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，免疫沉淀技術(shù)純化外源性CDK8，LC-MS/MS技術(shù)檢測該蛋白絲氨酸乙?；揎?。
　　4.檢測蛋白激酶CDK8的絲氨酸乙?；揎棇ζ淞姿峄δ艿挠绊?
　?、贅?gòu)建PCDNA3.0-Flag-CDK8突變質(zhì)粒[突變位點(diǎn)是把蛋白激酶CDK810、11位

4、上的絲氨酸分別突變成丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)，通過轉(zhuǎn)染把質(zhì)粒導(dǎo)入293T細(xì)胞表達(dá)，免疫沉淀技術(shù)純化外源性CDK8。
　?、跇?gòu)建PQE30-His-CTD質(zhì)粒，將表達(dá)的CTD蛋白與突變的蛋白激酶CDK837℃孵育一小時(shí)，LC-MS/MS技術(shù)檢測CTD蛋白的磷酸化修飾情況。鑒定蛋白激酶CDK8激酶10、11位絲氨酸乙?；揎棇Φ鞍准っ窩DK8激酶磷酸化功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1.質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)293

5、T中內(nèi)源性蛋白激酶CDK8發(fā)現(xiàn)大量絲氨酸位點(diǎn)都廣泛存在乙?；揎?，并且絲氨酸乙酰化修飾主要集中在功能域和亞基間相互作用結(jié)構(gòu)域。
　　2.質(zhì)譜檢測Ni柱純化后的外源性蛋白激酶CDK8，發(fā)現(xiàn)該外源蛋白激酶CDK8大量絲氨酸位點(diǎn)存在乙?；揎棥?br>　　3.質(zhì)譜檢測IP純化后的外源性蛋白激酶CDK8，發(fā)現(xiàn)大量絲氨酸位點(diǎn)也存在乙?；揎?，且修飾比例與原核表達(dá)的CDK8有差別。
　　4.蛋白激酶CDK8第10、11位的絲氨酸位點(diǎn)的乙