鹽藻絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、鹽藻(Dunaliella salina)是一種低等單細(xì)胞真核生物,屬于綠藻門(mén)、真綠藻綱、團(tuán)藻目、鹽藻科、鹽藻屬,是已知最為耐鹽的真核生物之一,是研究植物高鹽適應(yīng)的模式生物。多年以來(lái)許多學(xué)者從鹽藻適應(yīng)高鹽環(huán)境的滲透調(diào)節(jié)、耐鹽相關(guān)基因的克隆及鹽藻質(zhì)膜、胞漿蛋白質(zhì)組等方面進(jìn)行了研究,取得了一定的進(jìn)展。但到目前為止對(duì)其耐鹽的分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑仍不清楚。
　　蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)各種外界信號(hào)應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。蛋白激酶通過(guò)對(duì)底物蛋白

2、的磷酸化參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起重要作用的信號(hào)分子。由特定的蛋白激酶催化的特定蛋白磷酸化調(diào)控著細(xì)胞的基本進(jìn)程,如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分裂分化調(diào)控、基因表達(dá)調(diào)控等。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase, STPK)是最重要的一類(lèi)蛋白激酶,通過(guò)催化多種功能蛋白(如酶、受體、運(yùn)輸?shù)鞍?、調(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)蛋白等)的磷酸化,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生命活動(dòng)過(guò)程。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶

3、的研究對(duì)于闡明耐鹽的分子機(jī)制具有重要科學(xué)意義。因此,本研究克隆了鹽藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因,并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)的研究。主要的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)論如下:
　　1.通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)成功地克隆了鹽藻一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(GenBank Accession No.JN625213),命名為DsSTPK。DsSTPK基因的cDNA全長(zhǎng)為3129bp,其中5′UTR為242bp,3′UTR為703bp,開(kāi)放

4、閱讀框?yàn)?184bp,編碼727個(gè)氨基酸。
　　2.生物信息學(xué)分析表明:該蛋白為不具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的親水性蛋白,定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì);DsSTPK存在兩個(gè)保守區(qū)域(167-175位一個(gè)蛋白激酶的ATP結(jié)合區(qū)、293-305位一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性區(qū)),并且存在多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要元件為無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋,催化區(qū)在三維結(jié)構(gòu)上形成一個(gè)活性空腔;氨基酸序列同衣藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(XP_001701465.1

5、)有最高的相似性(65%),進(jìn)化分析表明,DsSTPK與衣藻和團(tuán)藻的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶親緣關(guān)系最近;活性分析顯示,DsSTPK與激活物磷脂酰絲氨酸(PS)、二酰甘油(DAG)、佛波酯(TPA)的結(jié)合能較低,結(jié)合較穩(wěn)定,并且催化組蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化。
　　3.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了其在高鹽(3M)脅迫下表達(dá)量的變化情況,結(jié)果表明:鹽藻在高鹽(3M)脅迫下DsSTPK的表達(dá)量明顯升高,且脅迫12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到

6、最高,為在正常生長(zhǎng)狀況下(1.5M)鹽藻中表達(dá)量的2.3倍,差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)DsSTPK的表達(dá)量逐漸降低,并恢復(fù)到正常水平。
　　4.利用DNA重組技術(shù)將DsSTPK的開(kāi)放閱讀框與質(zhì)粒pET32a(+)相連,構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET32a(+)-DsSTPK,再將原核表達(dá)載體導(dǎo)入E.coli.BL21(DE3)中,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),融合蛋白在上清和包涵體中均存在,將上清蛋白純化后獲得了純度較