絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶2A在mTOR信號通路中的基因表達研究.pdf

1、背景：
　　 雷帕霉素作為一種免疫抑制劑，其作用靶點mTOR是細胞增殖、生長、存活的中心控制者。在生長因子及營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下，mTOR通過下游效應(yīng)因子調(diào)節(jié)翻譯相關(guān)的蛋白及核糖體的生成和功能進而影響細胞周期。雷帕霉素通過抑制mTOR的活性導(dǎo)致T淋巴細胞的G1期停滯及阻止其他細胞從G1期進入S1期，因而在臨床上具有免疫抑制及抗腫瘤效應(yīng)。
　　 蛋白磷酸酶2A(PP2A)是真核細胞中廣泛存在的Ser/Thr蛋白磷酸酶，可對多種

2、細胞蛋白脫磷酸化，從而對多種反應(yīng)起到精細的調(diào)控作用。由催化亞基C(35KD)和支架亞基A(65KD)組成的核心酶與B亞基形成的三聚體ABC是細胞中PP2A的高度動態(tài)形式，因為B亞基至少有26個成員，分別屬于B、B'、B"、B'''四個亞族。PP2A功能的發(fā)揮和調(diào)節(jié)依賴于亞基之間的相互作用及翻譯后修飾。目前研究發(fā)現(xiàn)PP2A是mTOR信號通路中的一個組成部分。用雷帕霉素抑制mTOR后可引起PP2A相關(guān)的一系列磷酸化/去磷酸化事件，包括S6K

3、1，4E-BP1，JNK-1以及ERK1/2等。
　　 目前關(guān)于雷帕霉素對PP2A酶活性的影響存在很大的爭議，也是研究的熱點。然而，很少關(guān)于PP2A基因表達的報道。因此我們研究的主要目的是探索雷帕霉素對PP2A轉(zhuǎn)錄水平的影響，從而使我們更好地理解PP2A在mTOR信號通路中的作用。
　　 目的：
　　 分析雷帕霉素作用于JurkatT淋巴細胞的過程中，PP2A各主要亞基的轉(zhuǎn)錄表達變化，以明確PP2A是否參與了mT

4、OR信號通路，及其在這個過程中的mRNA變化。
　　 方法：
　　 用不同濃度的雷帕霉素(0nM，10nM，100nM，500nM)處理JurkatT淋巴細胞至12h，24h及48h。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測T細胞的增殖及活力，應(yīng)用RT-PCR檢測PP2A各主要亞基(Aa，Aβ，PR55a，PR55δ，PR61γ，PR70,Ca及CB)的mRNA表達。使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料實驗數(shù)據(jù)以x

5、±s表示，數(shù)據(jù)錄入SPSS16.0完成統(tǒng)計分析。以P<0.05為有統(tǒng)計學差異，P<0.001為有顯著統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：
　　 雷帕霉素對Jurkat細胞生長及活力有明顯的抑制作用，48小時藥物的50％抑制濃度是343.3nM。雷帕霉素對PP2A基因表達也有劑量和濃度依賴效應(yīng)：500nM雷帕霉素作用細胞不同時間后，PP2A各亞基mRNA的表達在48h明顯下降；而用不同濃度的雷帕霉素處理Jurkat細胞48h后，各亞

6、基轉(zhuǎn)錄水平也明顯下降，且大部分亞基在100-500nM范圍內(nèi)降到最低。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗以人JurkatT淋巴細胞系為對象，研究雷帕霉素對體外共培養(yǎng)T細胞的作用。研究結(jié)果表明雷帕霉素在體外可以抑制T細胞增殖及活力。在這個過程中伴有PP2A基因的改變，說明雷帕霉素可能通過影響PP2A表達，進而通過改變其活性對T淋巴細胞發(fā)揮作用，這不僅使我們更深入了解mTOR的作用機制，同時PP2A相關(guān)蛋白也可能為我們提供預(yù)防免疫