日本血吸蟲絲-蘇氨酸蛋白磷酸酶新基因SjPP的研究.pdf

1、本論文從免疫篩庫獲得的5個EST序列中，選擇絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因進行了深入研究。絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶可逆轉(zhuǎn)蛋白激酶的作用過程，在蛋白質(zhì)的可逆磷酸化調(diào)節(jié)過程中具有重要作用。至今，對日本血吸蟲絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶的研究仍鮮有報道。 1.根據(jù)EST序列，利用5'RACE技術(shù)首次克隆獲得日本血吸蟲絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶新基因SjPP(GenBank登錄號AY902477)。該基因的ORF含906bp，編碼302個氨基酸，理論分子量34

2、.7kD，理論等電點5.51。生物信息學(xué)分析表明SjPP基因的編碼蛋白具有絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶的特征模塊GDXHGQ、GDXVDRG和RGNHE及特異性抑制劑岡田酸的結(jié)合位點SAPNYC，與PP2A亞家族蛋白PP6(72％)、PPV(71％)、PPE1(63％)、SIT4p(61％)、PP4C(59％)具有高度同源性。熒光定量PCR分析顯示SjPP基因在血吸蟲童蟲和成蟲中都有表達，表達量由高到低依次為31d成蟲、44d雌蟲、44d雄蟲、

3、14d童蟲和7d童蟲。 2.首次構(gòu)建SjPP的原核重組表達質(zhì)粒pET28a(+)-SjPP和核酸疫苗pCMV-SjPP，并對其免疫保護功能和免疫保護機制進行研究。 2.1含有pET28a(+)-SjPP的大腸桿菌BL21(DE3)在0.1mMIPTG誘導(dǎo)2h時，每克菌體產(chǎn)生約18mg以包涵體形式存在的重組蛋白rSjPP，Western-blot分析結(jié)果表明rSjPP具有良好的抗原性。ELISA結(jié)果顯示rSjPP蛋白能被東

4、方田鼠血清IgG、特別是IgG3很好地識別，可能是東方田鼠體液免疫作用的靶標(biāo)之一。 2.2酶學(xué)分析結(jié)果顯示，純化并經(jīng)透析復(fù)性的rSjPP具有絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性，最適反應(yīng)pH為8.0，最適作用溫度為60℃，1～4mMNi2+可增進rSjPP酶活性。 2.3rSjPP蛋白免疫BALB/c小鼠和昆明系小鼠后產(chǎn)生了高滴度的特異性IgG抗體，分別誘導(dǎo)產(chǎn)生了18.2％和17.8％的減蟲率、15.4％和40.8％的肝組織減卵率和

5、32.2％的糞便減卵率(BALB/c小鼠)。酶學(xué)分析顯示免疫組小鼠體內(nèi)血吸蟲的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶活性幾乎完全被抑制(抑制率95％)。顯示小鼠血清中特異性抗rSjPP抗體IgG對日本血吸蟲體內(nèi)SjPP蛋白發(fā)生作用，可能是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生減蟲效果和明顯的減卵效果的機制之一。從一個側(cè)面揭示了東方田鼠血清中IgG抗體抗血吸蟲的可能作用機理。 2.4核酸疫苗免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了26.8％的減蟲率，23.9％的肝組織減卵率和31.9

6、％糞便減卵率；免疫昆明鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了10.2％減蟲率，21.5％的肝組織減卵率。 3.成功構(gòu)建了SjPP基因的Bac-to-Bac表達系統(tǒng)，篩選出具有干擾作用的S312siRNA分子，為進一步研究SjPP的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 3.1構(gòu)建重組桿狀病毒Bacmid-SjPP，并實現(xiàn)在昆蟲細(xì)胞中的表達。重組病毒Bacmid-SjPP轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞TN5B1-4，轉(zhuǎn)染72h后融合蛋白f-SjPP的表達量最高。Western-bl

7、ot分析結(jié)果表明f-SjPP蛋白具有良好的抗原性。 3.2在體外培養(yǎng)條件下，成功篩選出對日本血吸蟲SjPP基因進行干擾的siRNA分子S312，在150nM、持續(xù)作用8d時，S312對SjPP基因表達的抑制效率為64.1％。目前，正在利用本實驗室制備的日本血吸蟲基因芯片，探討RNA干擾SjPP基因后日本血吸蟲基因表達譜的變化情況。 本論文首次較系統(tǒng)地開展了日本血吸蟲絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶的研究，對加深理解東方田鼠抗日本血吸