日本血吸蟲Nanos蛋白的基因定位與功能初步鑒定.pdf

1、目的：Nanos是RNA結(jié)合蛋白，在它的羧基端具有兩個在進(jìn)化上高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)域，常常作為翻譯抑制而發(fā)揮作用。Nanos基因最早是在模式生物果蠅的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，它與Pumilio基因一起發(fā)揮作用，參與果蠅體軸的正常發(fā)育，多年的研究表明 Nanos對于生殖細(xì)胞的分化發(fā)育的至關(guān)重要的，它可以調(diào)控生殖細(xì)胞的更新及向生殖腺的遷徙，并且可以抑制生殖細(xì)胞的早熟和傾向體細(xì)胞的分化。在本課題研究中，通過原位雜交和RAN干擾這兩個實驗方法，初步

2、確定了Nanos在日本血吸蟲的表達(dá)定位及功能。
　　方法：本研究首先利用BLAST軟件在日本血吸蟲Nanos基因的開放閱讀框中選取一段特異性的序列（第416-657堿基）以制備原位雜交所需要的探針。針對這段特異性的序列設(shè)計引物并送至公司合成，利用PCR技術(shù)擴增此段序列，然后將這段序列與PMD18-T載體連接構(gòu)建Nanos-PMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)XL1-BLUE大腸桿菌，用氨芐青霉素（AMP）篩選后挑取單個菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)

3、過 EcoRI和HindIII雙酶切鑒定后送至公司測序。經(jīng)公司測序正確后，EcoRI和HindIII雙酶切Nanos-PMD18-T質(zhì)粒，并將酶切產(chǎn)物與pspt19載體連接構(gòu)建Nanos-pspt19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、挑菌、提質(zhì)粒，經(jīng)過EcoRI和HindIII雙酶切鑒定后送至公司測序。測序正確后，HindIII或EcoRI單酶切Nanos-pspt19質(zhì)粒，分別得到制備正義鏈探針或反義鏈探針的模板，并通過DIG RNA Label

4、ing Kit(SP6/T7)試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，從而得到正義鏈探針或反義鏈探針。制備成功的探針可放置在-80℃保存、備用，按終濃度為5ng/ml用于原位雜交。冰上分離18天、24天和42天雌雄蟲，經(jīng)過固定、蛋白酶K處理、雜交、顯色等步驟，使用正置熒光顯微鏡拍照。
　　本課題運用RAN干擾的方法鑒定Nanos蛋白的功能。首先根據(jù)軟件設(shè)計針對Nanos基因的5段不同的siRNA序列，分別命名為N1、N2、N3、N4和N5并送至上海吉

5、瑪公司合成。6-8周昆明鼠感染60只左右的尾蚴，24天后殺鼠取蟲，剛?cè)〕龅难x經(jīng)過無菌PBS和1640培養(yǎng)基洗滌后，將血吸蟲放入12孔板內(nèi)用2 ml1640培養(yǎng)基+10％血清+三抗培養(yǎng)48小時。在培養(yǎng)的這72小時的過程中，0小時和24小時分別用Permute轉(zhuǎn)染試劑將終濃度為200nM的SiRNA轉(zhuǎn)染日本血吸蟲。培養(yǎng)72小時后，分別提取各組日本血吸蟲的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后通過熒光定量PCR技術(shù)確定之前設(shè)計的5段SiRNA中基

6、因沉默效果最好的一段，最后用此段 siRNA構(gòu)建能夠表達(dá) shRNA的 RNAi質(zhì)粒并包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，將帶有目的RNAi質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒與18天日本血吸蟲共培養(yǎng)兩周左右，研究干擾后日本血吸蟲基因水平、蛋白水平及形態(tài)的改變。
　　結(jié)果：雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳及測序結(jié)果均顯示Nanos-PMD18-T重組質(zhì)粒和Nanos-pspt19重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。利用HindIII或EcoRI單酶切Nanos-pspt19質(zhì)粒得到Nanos基因

7、正義鏈探針或反義鏈探針的模板，成功體外轉(zhuǎn)錄Nanos基因正義鏈探針或反義鏈探針，并以此用于18天、24天和42天血吸蟲的原位雜交。原位雜交結(jié)果顯示18天、24天和42天血吸蟲雌蟲的反義鏈探針組有明顯藍(lán)色陽性信號，而雄蟲未見任何陽性信號。將終濃度為200nM的小干擾RNA片段N1、N2、N3、N4及N5分別與24天日本血吸蟲共培養(yǎng)72小時后提取各組日本血吸蟲的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄cDNA，通過熒光定量PCR技術(shù)確定N3對Nanos基因表達(dá)的消

8、減效果最明顯。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染18天日本血吸蟲，實驗組為可以表達(dá)Nanos基因shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒，對照組為表達(dá)亂序的不針對日本血吸蟲任何基因的shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒感染18天日本血吸蟲后體外培養(yǎng)14天，分別提取未處理組、對照組及實驗組蟲體總RNA，通過Q-PCR實驗顯示對照組Nanos基因水平表達(dá)不降低，實驗組Nanos基因水平表達(dá)下降65%左右。蟲卵計數(shù)結(jié)果顯示實驗組較對照組減卵率達(dá)28%，實驗組蟲卵明顯變小并且成熟度明顯降低

9、。激光共聚焦顯微鏡下觀察干擾后雌雄蟲的形態(tài)變化，其中雌蟲的卵巢周圍出現(xiàn)大的空泡，卵巢內(nèi)細(xì)胞排列疏松，形態(tài)異常；而雄蟲睪丸未見明顯的形態(tài)改變。
　　結(jié)論：本實驗通過18天、24天和42天發(fā)育階段的日本血吸蟲整蟲原位雜交結(jié)果顯示Nanos基因高表達(dá)于24天和42雌蟲卵巢和卵黃腺，18天雌蟲高表達(dá)于卵巢，而雄蟲未觀察到陽性信號。RNAi實驗結(jié)果顯示 Nanos基因水平表達(dá)下降65%左右，蟲卵計數(shù)結(jié)果顯示減卵率達(dá)28%，蟲卵明顯變小并且成