日本血吸蟲Wnt信號(hào)通路受配體的鑒定及初步分析.pdf

1、血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的，是一種嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病。長期以來對(duì)于血吸蟲病的防治主要采取藥物治療(吡喹酮)的方法，但是長期反復(fù)的用藥容易引起血吸蟲的耐藥性，因此研制新的抗血吸蟲病的治療藥物是當(dāng)前的首要任務(wù)。若使血吸蟲病新藥的研究取得突破性的進(jìn)展，研究者們需充分了解血吸蟲生長發(fā)育的過程及其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。由Wnt蛋白、Frizzled家族受體蛋白及其相關(guān)的上下游信號(hào)分子構(gòu)成的Wnt信號(hào)通路，是細(xì)胞發(fā)育和生長調(diào)節(jié)的關(guān)鍵途徑

2、，對(duì)動(dòng)物的生長發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。本課題組已經(jīng)成功的獲得了日本血吸蟲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Sj Wnt4和Sj Wnt2，以及3個(gè)Wnt受體蛋白Frizzled的基因以及其它一些相關(guān)分子，并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)及生物學(xué)功能的研究，初步確定在日本血吸蟲體內(nèi)也存在Wnt信號(hào)通路。但是對(duì)于Wnt信號(hào)通路在血吸蟲生長發(fā)育中的功能及分子機(jī)制需有待進(jìn)一步闡明。
　　 本研究的方法如下：將日本血吸蟲與曼氏血吸蟲已知的Wnt和Frizzled序列進(jìn)行同源性

3、比對(duì)，選擇保守性好的氨基酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，利用touch-up PCR方法擴(kuò)增日本血吸蟲Wnt信號(hào)通路受配體編碼基因的EST，再利用RACE技術(shù)、電子拼接等方法獲得全長序列；利用GenomeWalkerTM Universal Kit分析日本血吸蟲Wnt2的基因結(jié)構(gòu)。利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建SjWnt2-(60aa-368aa)基因的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白的表達(dá)、純化及免疫原性分析，制備SjWnt2

4、-(60aa-368aa)的小鼠多抗血清，ELISA技術(shù)測(cè)定抗體效價(jià)，Western blot方法鑒定血清的特異性；利用免疫組化(IHC)方法檢測(cè)SjWnt2-(60aa-368aa)和SjFz5蛋白在不同期別蟲體的組織定位。
　　 主要研究結(jié)果：(1)獲得日本血吸蟲Wnt信號(hào)通路新基因4個(gè)，其中3個(gè)(Sjwnt5a、Sjwnt1、Sjwnt11)為Wnt家族相關(guān)基因，1個(gè)(Frizzled8)為Frizzled受體基因；對(duì)已獲

5、得的Wnt2基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)其含有4個(gè)內(nèi)含子，其中內(nèi)含子1、3、4由于序列比較長未完全測(cè)通，內(nèi)含子2大小為653 bp。(2)成功構(gòu)建SjWnt2-(60aa-368aa)基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行了表達(dá)，Western blotting顯示表產(chǎn)物能被日本血吸蟲蟲卵抗原免疫兔血清所識(shí)別，具有良好的抗原性。將表達(dá)、純化后的抗原免疫小鼠，制備SjWnt2-(60aa-368aa)小鼠多抗血清，Western blotting顯

6、示SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白的抗血清能與蟲體天然蛋白中的單一蛋白條帶發(fā)生反應(yīng)。免疫組化(IHC)結(jié)果顯示SjWnt2-(60aa-368aa)蛋白主要分布在血吸蟲童蟲和成蟲的吸盤及體壁肌層細(xì)胞膜上，而且在雌雄蟲的生殖器也有明顯定位。(3)免疫組化(IHC)結(jié)果顯示SjFz5蛋白呈現(xiàn)廣泛分布，在蟲體的口吸盤、腹吸盤、體壁肌細(xì)胞層等都有陽性著色。另外，在雌蟲卵細(xì)胞、卵黃細(xì)胞以及雄蟲的精細(xì)胞上都可見明顯的陽性反應(yīng)。
　　

7、 總之，本論文成功獲得了與Wnt信號(hào)通路相關(guān)的可能配體.Sjwnt5a.Sjwnt1、Sjwnt11及可能的受體Frizzled8基因，為進(jìn)一步探索日本血吸蟲Wnt信號(hào)通路受配體相互作用提供了實(shí)驗(yàn)材料。并對(duì)已有的SjWnt2和SjFz5進(jìn)行了免疫組化定位分析，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，SjWnt2和SjFz5蛋白均在血吸蟲雌雄蟲的生殖器上有明顯的定位。初步推測(cè)SjWnt2和SjFz5可能參與調(diào)節(jié)兩性生殖細(xì)胞的發(fā)育，本研究為深入的研究Wnt信號(hào)通路