日本血吸蟲(chóng)致弱尾蚴差異表達(dá)蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、血吸蟲(chóng)病(schistosomiasis)是由血吸蟲(chóng)(schistosome)感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，主要流行于亞洲、非洲、拉丁美洲的76個(gè)國(guó)家和地區(qū)。我國(guó)主要流行日本血吸蟲(chóng)病，至今已有2100年歷史。據(jù)2006年全國(guó)疫情調(diào)查資料顯示，我國(guó)大部分流行地區(qū)已消滅或控制了血吸蟲(chóng)病，但尚有105個(gè)血吸蟲(chóng)病流行縣(市、區(qū))，約67萬(wàn)感染者，且近年來(lái)疫情有所回升，并伴隨出現(xiàn)向城市蔓延的趨勢(shì)，因此。血吸蟲(chóng)病防治仍然是我國(guó)重

2、要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。 目前國(guó)內(nèi)外防治血吸蟲(chóng)病的主要措施是采取人畜同步化療、易感地帶滅螺等相結(jié)合的綜合性防治方法，但由于現(xiàn)有的以吡喹酮為主要藥物的化療不能有效防治治療后再感染，且存在低敏感蟲(chóng)株及潛在藥物耐藥性的威脅，使得血吸蟲(chóng)病的有效防治受到阻礙。上世紀(jì)80年代，研究者們確立了以發(fā)展血吸蟲(chóng)病疫苗作為防治血吸蟲(chóng)病的研究重點(diǎn)，使藥物化療的短效作用與疫苗接種的長(zhǎng)效免疫預(yù)防作用相結(jié)合，不僅能有效減少疾病的總體發(fā)病率，也能避免單純化療后的

3、重復(fù)感染。 抗血吸蟲(chóng)病疫苗的研究歷經(jīng)了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程蛋白疫苗及核酸疫苗幾個(gè)階段，目前主要集中在特異性重組蛋白疫苗及核酸疫苗方向，通過(guò)模擬宿主自然感染后產(chǎn)生的保護(hù)性機(jī)理，以具有保護(hù)能力的抗血清或單抗篩選蟲(chóng)體cDNA文庫(kù)來(lái)尋找特異的保護(hù)性相關(guān)抗原。然而，近30年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究已證明，這種單純以刺激Th1或Th2型體液免疫應(yīng)答為主的特異性抗原分子疫苗并不能穩(wěn)定地誘導(dǎo)動(dòng)物模型高效的保護(hù)性免疫力。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世紀(jì)6

4、0年代末。大量實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)輻照致弱的侵襲性曼氏血吸蟲(chóng)或日本血吸蟲(chóng)尾蚴能穩(wěn)定誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生高達(dá)90％的保護(hù)性免疫力，是目前公認(rèn)的最高效、穩(wěn)定的抗血吸蟲(chóng)病疫苗。對(duì)曼氏血吸蟲(chóng)致弱尾蚴疫苗的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種保護(hù)性免疫力主要是由獲得性免疫機(jī)制介導(dǎo)的，由Th1型優(yōu)勢(shì)細(xì)胞免疫應(yīng)答向Th2型優(yōu)勢(shì)體液免疫應(yīng)答發(fā)展的持續(xù)性免疫應(yīng)答過(guò)程。致弱尾蚴在入侵皮膚處刺激天然免疫系統(tǒng)細(xì)胞的應(yīng)答，釋放或分泌的大量蟲(chóng)體抗原可直接促進(jìn)天然免疫細(xì)胞分泌產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因

5、子及趨化因子，或者被遞呈給皮膚引流淋巴結(jié)，刺激Th1表型T細(xì)胞大量增殖活化而激發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。雖然后續(xù)Th2型優(yōu)勢(shì)體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)機(jī)制不是很清楚，但其與高效的保護(hù)性免疫力水平是直接相關(guān)的。 輻照致弱尾蚴疫苗已被證實(shí)是目前疫苗研究開(kāi)發(fā)的最理想模擬模型，而目前對(duì)其研究主要集中在免疫宿主的免疫效應(yīng)分子機(jī)制方面，有關(guān)保護(hù)性特異抗原分子的尋找也局限在使用保護(hù)性血清進(jìn)行免疫沉淀、Western blot及篩選蟲(chóng)體cDNA文庫(kù)等方法。由于

6、輻照射線具有較高能量，可能破壞或損傷蟲(chóng)體DNA結(jié)構(gòu)而影響mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終引起相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平或結(jié)構(gòu)的變化。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能與正常非照射尾蚴分泌或脫落的蛋白有所不同，可能是致弱尾蚴誘導(dǎo)高水平保護(hù)性免疫力的分子基礎(chǔ)。因此，對(duì)致弱尾蚴蟲(chóng)體總蛋白質(zhì)水平變化的認(rèn)識(shí)能為深入探索高效的保護(hù)性免疫機(jī)制及疫苗的研究提供扎實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的： 本研究旨在對(duì)紫外線輻照致弱日本血吸蟲(chóng)尾蚴的可溶性蟲(chóng)體總蛋白質(zhì)表達(dá)譜及差異

7、表達(dá)蛋白進(jìn)行分析與鑒定，擬為揭示致弱尾蚴誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平保護(hù)性免疫力的效應(yīng)機(jī)制的可能分子基礎(chǔ)提供在蟲(chóng)體蛋白質(zhì)水平上的全面認(rèn)識(shí)，另一方面也為模擬這一機(jī)制以研制抗血吸蟲(chóng)病疫苗提供新的思路和有效的疫苗候選分子。 研究方法： 研究方法主要包括采用雙向電泳技術(shù)對(duì)紫外線輻照致弱尾蚴(UVAC)及正常尾蚴(NC)的可溶性蟲(chóng)體總蛋白質(zhì)譜進(jìn)行比較與分析，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行MALDI—TOF—MS質(zhì)譜鑒定，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其中4個(gè)表

8、達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)蛋白在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的變化及與紫外線輻照劑量及作用時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行探討。此外，對(duì)這4個(gè)表達(dá)上調(diào)的蛋白進(jìn)行基因克隆及重組蛋白的原核表達(dá)與鑒定，并采用ELISA、Western blot及淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)等對(duì)重組蛋白的抗原性、免疫原性及免疫細(xì)胞刺激效應(yīng)等功能進(jìn)行檢測(cè)。 研究結(jié)果： 1.正常尾蚴與紫外線輻照致弱尾蚴可溶性蟲(chóng)體總蛋白的雙向電泳分離經(jīng)雙向電泳(pH3-10，20 cm×24 cm×0.1 cm

9、)的分離及銀染，獲得NC及UVAC可溶性蟲(chóng)體總蛋白質(zhì)圖譜，分別于圖譜上獲得1458±29及1379±45個(gè)蛋白斑點(diǎn)，絕大部分蛋白點(diǎn)分布于分子量20kDa～97kDa、等電點(diǎn)4～8之間。 2.紫外線輻照致弱尾蚴可溶性差異表達(dá)蛋白的鑒定 比較NC與UVAC兩組樣本圖譜間斑點(diǎn)相對(duì)體積的差異，選取差異比值大于1.5的71個(gè)斑點(diǎn)作為差異表達(dá)蛋白候選斑點(diǎn)。15個(gè)蛋白斑點(diǎn)在UVAC組表達(dá)上調(diào)，其中有5個(gè)為在UVAC組中特異性表達(dá)；56

10、個(gè)蛋白斑點(diǎn)在UVAC組表達(dá)下調(diào)，其中有8個(gè)在UVAC組中未見(jiàn)表達(dá)。使用MALDI—TOF—MS成功鑒定出其中20個(gè)斑點(diǎn)，4個(gè)在UVAC組中表達(dá)上調(diào)，其中1個(gè)為在UVAC組中特異性表達(dá)；16個(gè)在UVAC組中表達(dá)下調(diào)，其中2個(gè)在UVAC組中未見(jiàn)表達(dá)。據(jù)功能可將這些差異表達(dá)蛋白大致分為5類，分別為：細(xì)胞骨架與結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄/翻譯與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/調(diào)控相關(guān)蛋白、熱休克家族相關(guān)蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶體等。 3.差

11、異表達(dá)蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平與紫外線輻照劑量及作用時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)4個(gè)表達(dá)上調(diào)差異表達(dá)蛋白SjActin、SjADH、SjHSP70、Sjβ—Tubulin的編碼基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行定量分析，并對(duì)這種變化與紫外線輻照劑量及作用時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果顯示在300μW/cm2及400μW/cm2較高UV劑量處理下4個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均表現(xiàn)為上調(diào)，而在100μW/cm2及200μW/cm2低U

12、V劑量處理下轉(zhuǎn)錄水平變化不明顯。輻照后1d即可出現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，而隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄水平的變化呈現(xiàn)恢復(fù)的趨勢(shì)。 4.差異表達(dá)蛋白全長(zhǎng)編碼基因的擴(kuò)增、克隆及表達(dá) 根據(jù)NCBI GenBank中日本血吸蟲(chóng)SjActin、SjADH、SjHSP70、Sjβ—Tubulin基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物從尾蚴cDNA噬菌體文庫(kù)中擴(kuò)增各基因的全長(zhǎng)編碼序列，并定向克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)或pET30a(+)中，經(jīng)PC

13、R、雙酶切及測(cè)序鑒定克隆成功。將成功構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行重組融合蛋白原核表達(dá)，經(jīng)His—tag親和層析柱純化獲得高純度的重組融合表達(dá)蛋白(rSjActin、rSjADH、rSjHSP70、rSjβ—Tubulin)，并經(jīng)質(zhì)譜鑒定證實(shí)。 5.差異表達(dá)重組蛋白的免疫學(xué)功能研究 將純化后rSjActin、rSjADH、rSjHSP70、rSjβ—Tubulin分別免疫Balb/c小鼠，獲得高效價(jià)

14、特異性免疫血清。ELISA及Western blot檢測(cè)顯示這4種重組蛋白均具有良好的免疫原性及免疫反應(yīng)性。小鼠致敏脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示4個(gè)重組融合蛋白對(duì)UVAC免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均具有一定的刺激作用。 討論與小結(jié)： 本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)紫外線輻照致弱日本血吸蟲(chóng)尾蚴差異表達(dá)的可溶性蟲(chóng)體蛋白進(jìn)行分析與鑒定，發(fā)現(xiàn)輻照后蟲(chóng)體總蛋白表達(dá)量下降，且一些細(xì)胞骨架與結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄/翻譯與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)/

15、調(diào)控相關(guān)蛋白、熱休克家族相關(guān)蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶體等5類功能蛋白分子表達(dá)發(fā)生變化；此外還發(fā)現(xiàn)這種變化在高劑量輻照處理后1d即發(fā)生，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)恢復(fù)趨勢(shì)，表明輻照對(duì)蟲(chóng)體的影響具有一定的時(shí)效性。其中表達(dá)上調(diào)的4個(gè)蛋白分子經(jīng)克隆、表達(dá)獲得的重組融合蛋白具有良好的免疫原性及免疫反應(yīng)性，并對(duì)紫外線輻照致弱尾蚴免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有一定的刺激作用。 本研究在國(guó)際上首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)紫外線輻照致弱尾蚴的蟲(chóng)體