一種新的金龜子綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的純化、特性及基因克隆.pdf

1、本文以金龜子綠僵菌蝗變種（Metarhizium anisopliae var. Acridum ）CQMa102菌株為研究材料，用酪蛋白從液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出一條pI為9.45的磷酸酶，純化后酶特性研究表明是一種嗜熱酶。該酶的氨基酸序列分析表明其與真菌堿性磷酸酶同源，但其底物特異性、酶抑制劑的專一敏感性和含有酪氨酸蛋白磷酸酶的標(biāo)志序列證明這是一個新的酪氨酸蛋白磷酸酶。而且，該酶在體外能改變其寄主（蝗蟲）血淋巴中與信號傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白（To

2、ll-like receptor）的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而可能干涉寄主體內(nèi)免疫活動，這為設(shè)計和改造新的真菌殺蟲劑提供一種新的技術(shù)途徑，具有重要的理論與應(yīng)用價值。 全文的主要結(jié)論如下： 一、發(fā)酵條件研究 采用單因子實驗分析培養(yǎng)條件對綠僵菌生長及產(chǎn)酸性磷酸酶的影響，結(jié)果表明，有機(jī)氮、葡萄糖和蛋白有機(jī)磷有利于綠僵菌生長和產(chǎn)酸性磷酸酶。酸性磷酸酶同工酶分析表明，酪蛋白作為磷源培養(yǎng)綠僵菌時，有一條比較特別的磷酸酶帶出現(xiàn)，其pI為

3、9.45，明顯不同于其他磷源。因此，我們選擇了這條磷酸酶帶為我們純化的目標(biāo)。根據(jù)實驗結(jié)果確定了純化目標(biāo)蛋白的培養(yǎng)條件為：葡萄糖，20g/L；(NH4)2SO4，2g/L；酪蛋白，4g/L；KCl，0.5g/L；MgSO4，0.5g/L；微量元素混合液，10ml/L；接種量，1×107孢子/100ml培養(yǎng)基；裝液量，100ml；10g/LMES，pH 6.0；在27°C條件下振蕩（160rpm）培養(yǎng)78h。 二、蛋白純化及特性研究

4、 培養(yǎng)液經(jīng)過ConA-Sepharose親和層析、HighQ陰離子交換層析和25S陽離子交換層析后，得到均一性好，純度高的目標(biāo)蛋白，回收率達(dá)41％。電泳法測定蛋白的pI為9.45，分子量為82.5kDa，用TMSF去糖基后表觀分子量為69kDa，因此該蛋白含碳水化合物16.4％。酶底物特異性研究表明該磷酸酶對磷酸酪氨酸殘基底物專一性強(qiáng)，而且絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑（EDTA 、NaF和岡田酸）、酸性磷酸酶抑制劑（EDTA、

5、酒石酸鈉）和堿性磷酸酶抑制劑（EDTA）對酶酶解pNPP和O-phospho-L-tyrosine活性沒有明顯的抑制作用；但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑（鉬酸鈉、原釩酸鈉、N-乙基馬來酰亞胺和鎢酸鈉）顯著抑制酶對O-phospho-L-tyrosine的酶解活性，因此該磷酸酶應(yīng)該是酪氨酸蛋白磷酸酶。該酶的最適作用溫度大約是75°C，最適pH是5.5，熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性好。除Ni2+外，Ca2+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2

6、+和Ba2+在5mM以上都明顯抑制酶降解pNPP的活性。Zn2+、Fe2+、Cu2+和Ag+顯著抑制酶水解O-phospho-L-tryosine的活性，而Mn2+和Ba2+顯著促進(jìn)酶水解O-phospho-L-tryosine活性，Co2+、Ni2+、Ca2+和Mg2+對酶水解O-phospho-L-tryosine活性沒有明顯影響。 三、酪氨酸蛋白磷酸酶基因克隆及分析 酶蛋白經(jīng)肽指紋質(zhì)譜分析和肽段質(zhì)譜de novo測

7、序，得到了五個肽段的氨基酸序列：NIQYGTGVNFPSNWEPR，DITNFFGVKEPEVEK，GNDSALDLPGLK， ALGDLLELDDTVR，WYEDLFAEDK。根此設(shè)計兼并引物，從綠僵菌DNA中擴(kuò)增出一條72bp的核酸片段。用該核酸片段作為探針，用32P末端標(biāo)記，結(jié)合PCR方法，從綠僵菌基因組文庫中篩選出了含該磷酸酶DNA的陽性克隆。其核酸序列分析結(jié)果表明，該基因DNA上含有3個內(nèi)含子，都是典型的GT……AG結(jié)構(gòu)，三段

8、內(nèi)含子的長度都比較短，共182bp，占該基因核酸總量的7.3％。該基因的啟動子特征不很明顯，但含有TATAA box轉(zhuǎn)錄起始框，和TGACGCCA和TGATAA轉(zhuǎn)錄激活序列，表明這是一個啟動子。再利用RACE法克隆該酶的cDNA，共2287bp，編碼一個含684個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中包含質(zhì)譜測序獲得的5個肽段氨基酸序列，證明克隆正確。同時該氨基酸序列中包含有酪氨酸蛋白磷酸酶的標(biāo)志序列HCX5R(S/T)，從分子水平證明該酶是酪氨酸蛋白磷

9、酸酶。 ORF編碼的氨基酸序列在http://www.expasy.org/tools/網(wǎng)站上信號肽分析結(jié)果顯示，該序列包含有一明顯的信號肽LAKLNVAAVLAASLSVVSA，這段肽疏水性強(qiáng)，擁有跨膜螺旋。其切割位點特征突出，在切割位點的C-端有一個帶有很短側(cè)鏈的丙氨酸。推導(dǎo)氨基酸序列的糖基化位點分析表明該酶蛋白是以N-連接型糖基化基團(tuán)為主，基本不含O-連接型糖基化基團(tuán)。這也得到實驗證實。因為TMSF是去的N-連接型，而不去