綠僵菌侵染蝗蟲差異糖蛋白及其酪氨酸蛋白磷酸酶在寄主血淋巴中的靶標(biāo)蛋白分析.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌,在東亞飛蝗防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比,真菌殺蟲劑盡管安全,無環(huán)境污染,但存在著殺蟲速率慢的缺點(diǎn),這在很大程度上阻礙了綠僵菌殺蝗劑的應(yīng)用。研究病原真菌侵染過程中,昆蟲與病原真菌相互作用,探索昆蟲的防御機(jī)制和病原真菌的致病機(jī)理可為發(fā)展新型高效真菌殺蟲劑提供依據(jù)。病原真菌侵入昆蟲血腔后到寄主死亡前,是決定病原真菌是否能殺死寄主的關(guān)鍵時(shí)期,病原真菌

2、與寄主兩者間發(fā)生著非常復(fù)雜的相互作用。一方面,病原真菌通過釋放破壞素以降低寄主的細(xì)胞防御反應(yīng),分泌葡萄糖苷酶、海藻糖酶和酸性磷酸酶等水解酶類以分解利用寄主體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),從而耗竭寄主體內(nèi)營養(yǎng);另一方面,寄主也會(huì)通過細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)積極抵御病原真菌的侵染。糖蛋白和磷酸化蛋白是廣泛分布在生物體內(nèi)的兩種主要的翻譯后修飾蛋白。這兩種蛋白都在生物體的多種生命活動(dòng)過程中起著重要的作用。近年來,針對糖蛋白和磷酸化蛋白的研究,特別是一些與疾病和免疫有

3、關(guān)的糖蛋白研究已成熱點(diǎn),為認(rèn)識一些疾病的分子機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ),并為通過基因工程手段治療這些疾病提供了作用靶標(biāo)。本研究以東亞飛蝗和金龜子綠僵菌(M. anisopliae)菌株CQMa102為研究材料,首次用高通量、高分辨率的雙向電泳技術(shù)在感病昆蟲血淋巴中篩選出了13個(gè)差異表達(dá)糖蛋白點(diǎn)。通過對差異糖蛋白肽質(zhì)量指紋圖譜和肽段de novo測序分析,鑒定出了其中的3個(gè)蛋白。同時(shí)利用雙向電泳技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),在東亞飛蝗血淋巴磷酸化蛋白中找到

4、了2個(gè)綠僵菌PTPase靶標(biāo)磷酸化蛋白。通過關(guān)于這3個(gè)糖蛋白和2個(gè)磷酸化蛋白的研究報(bào)道,分析推測了它們的可能生理功能和在昆蟲與寄主相互作用過程中的可能作用。為了解病原真菌的致病機(jī)理和昆蟲的防御機(jī)制提供了理論依據(jù),也為進(jìn)一步研究這些蛋白在綠僵菌侵染東亞飛蝗過程中的確切作用奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:①東亞飛蝗健康雄成蟲在羽化后5d到13d這段時(shí)間,血淋巴內(nèi)的游離氨基酸含量基本衡定,保持在125μg/ml左右,而CQMa102侵染的東亞飛

5、蝗,隨侵染時(shí)間延長,血淋巴內(nèi)游離氨基酸含量不斷提高,到感染末期,游離氨基酸含量急劇提高,達(dá)到454.5μg/ml。②東亞飛蝗健康雄成蟲在羽化后5d到13d這段時(shí)間,血淋巴內(nèi)的蛋白質(zhì)含量基本衡定,保持在15.25mg/ml左右;而CQMa102侵染的東亞飛蝗血淋巴中的蛋白質(zhì)含量不斷降低,到第8d,其含量只有11.85mg/ml。③病原真菌侵染的前4d,血淋巴總蛋白SDS-PAGE表達(dá)譜沒有明顯變化,而在感染后第6d,昆蟲血淋巴蛋白譜發(fā)生了

6、顯著變化,感染昆蟲血淋巴較對照明顯新增了3條蛋白譜帶,1條蛋白譜帶較對照明顯減弱。④用Con A-Sepharose4B分離純化蝗蟲血淋巴糖蛋白,通過對照與感病昆蟲血淋巴糖蛋白雙向電泳圖譜比較分析,篩選出13個(gè)差異表達(dá)糖蛋白點(diǎn),其中9個(gè)表達(dá)水平發(fā)生上調(diào),4個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。⑤用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)獲得了10個(gè)差異蛋白的清晰肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting, PM

7、F)。但由于東亞飛蝗蛋白基因組和蛋白質(zhì)序列信息量較少,這些肽質(zhì)量指紋數(shù)據(jù)均未能通過MASCOT搜索引擎在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到顯著差異的檢索結(jié)果。⑥通過質(zhì)譜肽段de novo測序,獲得了4個(gè)差異蛋白的13個(gè)肽段氨基酸序列,用生物信息學(xué)方法,其中的3個(gè)被鑒定為transferrin( SGLDDVLSLDGGEALTAVR), Apolipophorin precursor protein(EIVAEGLLIDDNNEK)和hexamer

8、in storage protein(YDAYGNEMTLDEAR)。已有的研究資料表明, transferrin和hexamerin storage protein兩個(gè)蛋白與昆蟲的免疫反應(yīng)有關(guān)。其它10個(gè)差異表達(dá)糖蛋白仍為未知蛋白。⑦將蝗蟲血淋巴用磷酸化蛋白親和層析后得到的磷酸化蛋白用純化的綠僵菌PTPase作用,作用后的蛋白樣品經(jīng)雙向電泳比較分析得到兩個(gè)差異點(diǎn)。這兩個(gè)蛋白點(diǎn)用串聯(lián)質(zhì)譜分析后比對發(fā)現(xiàn)其中一點(diǎn)與Toll-like rec

9、eptor同源性好,而Toll-like receptor是介導(dǎo)昆蟲產(chǎn)生免疫反應(yīng)信號傳導(dǎo)物質(zhì),暗示該磷酸酶具有干擾蝗蟲體內(nèi)信號傳導(dǎo)的能力。另一點(diǎn)與Golgi autoantigen,golgin subfamily A member4(Trans-Golgi p230)同源性好,而該類蛋白與動(dòng)物的自身免疫疾病和有些蛋白特別是糖蛋白從高爾基體的外運(yùn)有關(guān),暗示該磷酸酶可能通過對該蛋白去磷酸化,阻礙某些糖蛋白的外運(yùn),尤其是某些重要的免疫糖蛋白