蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制劑篩選模型的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子,與人類疾病密切相關(guān)。SHP-1是含有SH2結(jié)構(gòu)域的具有高度保守序列的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的亞家族中的重要成員,研究表明,PTPs與糖尿病患者血糖控制以及糖尿病血管并發(fā)癥關(guān)系密切。尋找蛋白酪氨酸磷酸酶的高活性抑制劑對(duì)糖尿病和肥胖癥治療有著廣闊的應(yīng)用前景。
　　本課題我們從人腦組織中獲取mRNA,通過RT-PCR擴(kuò)

2、增出目標(biāo)cDNA,構(gòu)建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆進(jìn)行驗(yàn)證,將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli Transetta感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)SHP-1,獲得具有生物活性的體外重組SHP-1蛋白。同時(shí)對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明20℃,0.4 mmol/L IPTG對(duì)表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí),SHP-1在體外高效穩(wěn)定的表達(dá)。采用我們體外表達(dá)獲得的蛋白建立SHP-

3、1高通量篩選模型,對(duì)多種化合物用SHP-1抑制劑篩選模型進(jìn)行篩選,尋找高活性的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑,結(jié)果獲得活性化合物J11310。
　　實(shí)驗(yàn)中以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞和大鼠骨骼肌成肌L6細(xì)胞為研究對(duì)象,選用胰島素30nM作為陽性對(duì)照對(duì)照,評(píng)價(jià)了J11310對(duì)細(xì)胞糖代謝的影響。結(jié)果表明,樣品J11310對(duì)HepG2細(xì)胞和L6細(xì)胞無毒性,可劑量依賴性的促進(jìn)HepG2和L6細(xì)胞葡萄糖消耗,當(dāng)濃度為1μg/mL時(shí)能顯著性促進(jìn)細(xì)胞

4、葡萄糖消耗。提示樣品J11310的作用機(jī)制可能是通過促進(jìn)肝臟和外周對(duì)葡萄糖的利用起到降葡萄糖作用。在HepG2細(xì)胞中加入胰島素,控制樣品的有無,以羅格列酮10-5M為陽性對(duì)照,比較細(xì)胞葡萄糖消耗量以評(píng)價(jià)樣品有無胰島素的協(xié)同作用。結(jié)果顯示,J11310在HepG2細(xì)胞中有較好的胰島素協(xié)同性,作用強(qiáng)于羅格列酮,以1μg/mL作用最強(qiáng),隨著濃度降低,樣品對(duì)葡萄糖消耗的協(xié)同作用逐漸減弱,在10-4μg/mL,10-5μg/mL時(shí)無協(xié)同作用。用不

5、同濃度四氧嘧啶對(duì)RINm5F細(xì)胞進(jìn)行損傷,樣品不同濃度的J11310均對(duì)損傷的胰島細(xì)胞RINm5F無保護(hù)作用。用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞中PGC-1α、Pi-AMPK、Pi-IRS的表達(dá)量,結(jié)果顯示,樣品J11310與HepG2細(xì)胞作用后,磷酸化AMPK以及磷酸化IRs表達(dá)量增加,對(duì)PGC-1a的表達(dá)量無明顯影響。這提示,J11310可能通過激活A(yù)MPK活性發(fā)揮葡萄糖脂代謝調(diào)控作用,同時(shí)還提高了IRS磷酸化水平,繼而激活下游胰島信號(hào)的傳