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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,雖然HCC的診斷及治療取得了很大進(jìn)展,但總體療效仍不容樂(lè)觀。
SHP-1(src-homology domain2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1),是由PTPN6基因編碼的含有SH2結(jié)構(gòu)域的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶,可通過(guò)其去磷酸化作用影響細(xì)胞增
2、殖、分化、活性和凋亡。
本課題旨在通過(guò)對(duì)人肝癌標(biāo)本、體內(nèi)體外生物學(xué)效應(yīng)以及肝細(xì)胞特異性SHP-1基因敲除小鼠三個(gè)層面的研究來(lái)分析SHP-1對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的影響,并探索其作用機(jī)制。
方法:
一、SHP-1在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
1、SHP-1在肝癌及癌旁標(biāo)本中表達(dá)情況
2、SHP-1表達(dá)與臨床惡性表型關(guān)系
3、SHP-1與肝癌患者臨床預(yù)后關(guān)系
二、SHP-1對(duì)肝
3、癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用
1、SHP-1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響
2、SHP-1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響
3、SHP-1對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響
4、SHP-1對(duì)肝癌細(xì)胞皮下成瘤能力的影響
5、SHP-1對(duì)肝原位種植瘤模型的治療作用
三、SHP-1對(duì)小鼠肝癌發(fā)生與發(fā)展的影響及其治療作用
1、驗(yàn)證Ptpn6HKO小鼠肝臟中SHP-1表達(dá)情況
將Ptpn6f/f小鼠與
4、Alb-Cre小鼠雜交獲得可在肝細(xì)胞中特異性敲除SHP-1基因的Ptpn6HKO小鼠。對(duì)所有入組的小鼠于出生后第15天以及處死時(shí)進(jìn)行剪尾,并抽提鼠尾DNA,利用PCR檢測(cè)小鼠基因型。同時(shí)利用Western Blot檢測(cè)小鼠肝臟組織、分離的小鼠原代肝細(xì)胞、原代肝星狀細(xì)胞以及原代肝庫(kù)弗細(xì)胞中SHP-1蛋白表達(dá)是否與基因型相符,非肝細(xì)胞中SHP-1表達(dá)是否受影響。
2、肝細(xì)胞特異性缺失SHP-1后對(duì)小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌形成及轉(zhuǎn)移的影響
5、
將小鼠按照基因型分為肝細(xì)胞特異性SHP-1敲除組和對(duì)照兩組(Ptpn6HKO和Ptpn6f/f),按照體重分別在小鼠出生后第15天腹腔注射DEN(25μg/mg),后每2月處死一批小鼠觀察肝臟腫瘤發(fā)生率、大小、數(shù)量以及肺轉(zhuǎn)移率等指標(biāo),于小鼠出生后第11月終止實(shí)驗(yàn)。
3、SHP-1對(duì)小鼠肝癌的治療作用
該部分利用DEN誘導(dǎo)Ptpn6HKO小鼠形成肝癌(劑量和方法同前),在出生后第10月將小鼠隨機(jī)分為2組各7
6、只,分別通過(guò)尾靜脈注射AdSHP-1和AdGFP(2×109pfu/100μl,2次/周,共3周),最后一次尾靜脈注射病毒后一周處死小鼠,記錄小鼠體重、肝重、肝臟腫瘤大小、數(shù)量以及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生情況,判斷SHP-1對(duì)小鼠肝癌的治療作用。
四、SHP-1抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制
1、通過(guò)siRNA或腺病毒調(diào)控肝癌細(xì)胞株(Huh7)中SHP-1的表達(dá),利用WesternBlot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中MAPK、JAK/STAT、NF
7、κB、PI3K/AKT等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的變化。
2、利用Western Blot檢測(cè)小鼠原代肝細(xì)胞中異常的信號(hào)通路,進(jìn)一步在體內(nèi)完善SHP-1抑制肝癌的機(jī)制。
五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
研究數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩獨(dú)立樣本方差齊性數(shù)據(jù)采用Student'st檢驗(yàn);x2檢驗(yàn)分析兩樣本率的比較;生存分析采用Kaplan-Meier分析和logrank檢驗(yàn);方差非齊性的配對(duì)資料采用Wilcoxon
8、符號(hào)秩檢驗(yàn),而不配對(duì)資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異非常顯著。
結(jié)果:
一、SHP-1在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
1、SHP-1在肝癌及癌旁標(biāo)本中表達(dá)情況
在所檢測(cè)的136對(duì)肝癌組織標(biāo)本中,肝癌組織中SHP-1表達(dá)量顯著低于癌旁組織,且91.17%的肝癌組織SHP-1表達(dá)低于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織,其中45.59%的肝癌組織SHP-1表達(dá)
9、下調(diào)超過(guò)2倍。
2、SHP-1表達(dá)與臨床惡性表型關(guān)系
根據(jù)上述肝癌標(biāo)本的Real-Time PCR結(jié)果,選取其中臨床資料完整的84例肝癌患者樣本,根據(jù)其癌組織中SHP-1表達(dá)量的中位數(shù)將這些標(biāo)本分為SHP-1低表達(dá)組和SHP-1高表達(dá)組。和高表達(dá)組相比,SHP-1低表達(dá)組肝癌患者年齡明顯偏小、AFP表達(dá)顯著升高、腫瘤更大、TNM分期更晚。以上結(jié)果說(shuō)明SHP-1低表達(dá)的肝癌患者更早發(fā)生肝癌,且與腫瘤的惡性表型發(fā)生密切相
10、關(guān)。
3、SHP-1與肝癌患者臨床預(yù)后關(guān)系
按肝癌組織中SHP-1蛋白表達(dá)水平的中位數(shù),將271例肝癌病人分為SHP-1低表達(dá)組及高表達(dá)組。根據(jù)肝癌患者臨床生存期資料分析SHP-1表達(dá)與肝癌患者總體生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示SHP-1低表達(dá)組中肝癌患者總體生存期明顯低于高表達(dá)組。
二、SHP-1對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用
1、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞增殖
通過(guò)AdSHP-1過(guò)表達(dá)SHP-1后,
11、肝癌細(xì)胞株Huh7和PLC的增殖能力明顯受到抑制,另一方面,siSHP-1下調(diào)Huh7及PLC兩株細(xì)胞中SHP-1表達(dá)量后則促進(jìn)其生長(zhǎng)增殖能力。
2、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞遷移能力
利用AdSHP-1腺病毒上調(diào)SHP-1表達(dá)的肝癌細(xì)胞株(Huh7和PLC)遷移能力明顯受到抑制,而siSHP-1轉(zhuǎn)染后其遷移能力得到明顯增強(qiáng)。
3、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞侵襲能力
利用AdSHP-1腺病毒上調(diào)SHP-1
12、表達(dá)的肝癌細(xì)胞株(Huh7和PLC)侵襲能力明顯受到抑制,而siSHP-1下調(diào)SHP-1表達(dá)后其侵襲能力得到明顯增強(qiáng)。
4、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞皮下成瘤能力
(1)將AdGFP或者AdSHP-1處理后的Huh7細(xì)胞注射于小鼠皮下,在注射種植后第19天,37.5%(3/8)的AdGFP組小鼠可觸及皮下腫瘤形成,第25天,AdGFP組所有小鼠皆形成皮下腫瘤(8/8),但是AdSHP-1組小鼠直至第28天后才出現(xiàn)可觸及的
13、皮下腫瘤(3/8),直至實(shí)驗(yàn)截止時(shí)間(34天)AdSHP-1組也僅62.5%(5/8)小鼠形成皮下腫瘤。
(2)在所監(jiān)測(cè)的所有時(shí)間點(diǎn),AdSHP-1組Huh7細(xì)胞皮下成瘤體積皆明顯小于AdGFP組。
(3) AdSHP-1組小鼠皮下成瘤大小和瘤重明顯低于AdGFP組,且腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示AdSHP-1處理后SHP-1明顯過(guò)表達(dá),而生長(zhǎng)指數(shù)蛋白Ki67表達(dá)和AdGFP組相比卻明顯下降。
5、SHP-1對(duì)
14、肝原位種植瘤模型有治療作用
將帶luc-Huh7細(xì)胞皮下成瘤組織種植于小鼠肝臟后,經(jīng)尾靜脈注射AdGFP或者AdSHP-1腺病毒觀察SHP-1對(duì)原位種植瘤模型治療作用。
(1)AdSHP-1組小鼠肝臟熒光信號(hào)值顯著低于對(duì)照AdGFP組,AdGFP組中兩只小鼠因瘤荷太大死亡。
(2)剝離肝臟瘤體也發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SHP-1后明顯抑制了原位種植瘤的生長(zhǎng),瘤重顯著低于AdGFP組小鼠。
(3)免疫組化及Rea
15、l-Time PCR檢測(cè)證實(shí)AdSHP-1組小鼠肝臟瘤組織中SHP-1表達(dá)明顯高于對(duì)照AdGFP組。
三、SHP-1對(duì)小鼠肝癌發(fā)生與發(fā)展的影響及其治療作用
1、驗(yàn)證Ptpn6HKO小鼠肝臟中SHP-1表達(dá)情況
鼠尾DNA抽提后PCR鑒定基因敲除鼠(Ptpn6HKO)與對(duì)照小鼠(Ptpn6f/f)基因型。同對(duì)照小鼠相比,Ptpn6HKO組小鼠肝組織中總SHP-1表達(dá)量明顯降低,且原代肝細(xì)胞中幾乎不表達(dá)SHP-
16、1,原代肝星狀細(xì)胞以及庫(kù)弗細(xì)胞中SHP-1的表達(dá)無(wú)明顯改變。以上結(jié)果提示Ptpn6HKO小鼠有且只有肝細(xì)胞不表達(dá)SHP-1。
2、肝細(xì)胞特異性缺失SHP-1后促進(jìn)小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌形成及轉(zhuǎn)移
3、SHP-1對(duì)小鼠肝癌有治療作用
該部分利用DEN誘導(dǎo)Ptpn6HKO小鼠形成肝癌后通過(guò)尾靜脈注射AdGFP或者AdSHP-1,觀察SHP-1對(duì)肝癌的治療效果。
四、SHP-1抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制
17、r> (1) SHP-1能明顯抑制肝癌細(xì)胞JAK/STAT3、NFκB以及PI3K/AKT信號(hào)通路活化,對(duì)ERK以及p-38磷酸化水平無(wú)明顯影響。
(2) SHP-1缺失后,小鼠原代肝細(xì)胞中JAK/STAT3、NFκB和PI3K/AKT通路也明顯活化,ERK和p-38磷酸化水平亦無(wú)明顯改變。
結(jié)論:
1、SHP-1在肝癌組織中表達(dá)顯著降低,與肝癌患者臨床惡性表型以及臨床預(yù)后密切相關(guān)。
2、SHP
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