激活突變SHP-2酪氨酸磷酸酶對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制的探討.pdf

1、背景
　　肝癌是世界上三大引起死亡的癌癥之一,大約80％的肝癌患者是由肝炎病毒感染引起的,其中乙肝病毒攜帶者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)比正常人高5~15倍,大約有四分之一的乙肝病毒慢性感染者會(huì)發(fā)生肝硬化,每年有3%～8%乙肝病毒導(dǎo)致的肝硬化患者會(huì)惡化成肝癌。近年來越來越多的研究表明,SHP-2的激活突變及過度表達(dá)可能與實(shí)體瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展演化和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚未明確。
　　SHP-2是一種蛋白酪氨酸磷酸酶(

2、ProteinTyrosinePhosphatase,PTP),廣泛表達(dá)于各種組織和細(xì)胞中,主要在各種造血細(xì)胞中高表達(dá)。SHP-2在N末端含有2個(gè)SH2(即Src同源體2)結(jié)構(gòu)域,C末端含有1個(gè)PTP催化結(jié)構(gòu)域及2個(gè)酪氨酸殘基(Tyr542和Tyr580)以及一個(gè)富含脯氨酸(Pro)的模體。每個(gè)SH2區(qū)都具有獨(dú)立的磷酸酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)。生理狀態(tài)下N末端的SH2結(jié)構(gòu)域與PTP結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合抑制了SHP-2的催化活性,但在各種生長因子、干擾

3、素以及胰島素等刺激后,酪氨酸磷酸化的蛋白底物與SHP-2的兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,或SHP-2C端兩個(gè)酪氨酸位點(diǎn)磷酸化結(jié)合自身的SH2結(jié)構(gòu)域,暴露出PTP催化結(jié)構(gòu)域,從而使SHP-2蛋白去磷酸化活性得以恢復(fù),發(fā)揮酪氨酸磷酸酶活性和接頭蛋白的功能。近年來,SHP-2激活突變?cè)谘翰》矫嫜芯恳呀?jīng)取得許多可喜的成績,另外SHP-2基因在實(shí)體瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越引起人們的關(guān)注。研究表明在部分肝癌細(xì)胞株中也能檢測(cè)到SHP-2是呈高水平表達(dá)的;

4、因此推測(cè)SHP-2可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了至關(guān)重要的作用。然而目前有關(guān)SHP-2與肝癌相關(guān)性研究很少有報(bào)道,本課題我們將對(duì)其進(jìn)行研究。
　　方法
　　(1)本研究用成功構(gòu)建的SHP-2真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2,篩選并鑒定了穩(wěn)定表達(dá)SHP-2的HepG2細(xì)胞株;
　　(2)檢測(cè)SHP-2激活突變及過表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、克隆形成能力、凋亡和遷移侵襲的影響;
　　(3)分析SHP-2對(duì)肝癌細(xì)胞

5、惡性生物學(xué)行為影響的可能作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　(1)成功的將SHP-2野生型及突變型真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2細(xì)胞,挑取的單克隆細(xì)胞,經(jīng)Westernblot的篩選和鑒定,最終篩選出穩(wěn)定表達(dá)SHP-2的HepG2單克隆細(xì)胞株。
　　(2)SHP-2激活突變及過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和周期的影響:MTT結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染的HepG2組和空載組細(xì)胞增殖速度接近,而突變組和過表達(dá)組增殖率明顯增加;平板克隆和軟瓊脂克隆形成實(shí)

6、驗(yàn)結(jié)果表明突變組及過表達(dá)組單克隆細(xì)胞不僅數(shù)目多于對(duì)照組和空載體組,而且體積比對(duì)照組和空載體組大;細(xì)胞周期檢測(cè)顯示突變組和過表達(dá)組S期細(xì)胞增殖明顯快于對(duì)照組和空載組細(xì)胞。說明轉(zhuǎn)染SHP-2后增加了細(xì)胞的生長能力。
　　(3)SHP-2激活突變及過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞粘附能力和凋亡的影響:粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,突變及過表達(dá)組細(xì)胞粘附率高于對(duì)照組和空載體組;凱基Annexin-V/EGFP試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變組及過表達(dá)組凋亡細(xì)胞均

7、明顯低于對(duì)照組和空載體組。說明轉(zhuǎn)染SHP-2增加了細(xì)胞的粘附和抗凋亡能力。
　　(4)SHP-2激活突變及過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和體外侵襲能力的影響:細(xì)胞劃痕和Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移法發(fā)現(xiàn),激活突變及過表達(dá)組細(xì)胞遷移率明顯高于空載體組和對(duì)照組;Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲能力發(fā)現(xiàn),對(duì)照組和空載體組細(xì)胞的侵襲率明顯低于激活突變及過表達(dá)組。說明SHP-2具有增強(qiáng)HepG2細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的作用。
　　(

8、5)轉(zhuǎn)染SHP-2突變型及野生型真核表達(dá)載體后CD133的表達(dá)情況:流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SHP-2激活突變及過表達(dá)細(xì)胞中CD133的表達(dá)量明顯高于空載體組和對(duì)照組,說明轉(zhuǎn)染SHP-2能促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的形成。
　　(6)SHP-2激活突變及過表達(dá)影響肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為可能機(jī)制:Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SHP-2激活突變及過表達(dá)組細(xì)胞磷酸化的AKT/ERK以及p38的水平明顯高于空載體組和對(duì)照組,表明轉(zhuǎn)染SHP-2可促進(jìn)PI