BATF2在原發(fā)性肝癌中的表達及其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第一部分 BATF2在原發(fā)性肝癌中的表達及其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 靶向治療是一種極具前景的肝癌治療方法,它針對肝癌生長過程中關(guān)鍵的基因或通路發(fā)揮抗腫瘤作用。因此,加強肝癌病因?qū)W的研究成為目前人類與肝癌抗?fàn)幍年P(guān)鍵之一。肝癌的發(fā)生過程是多因素、多階段、多步驟的復(fù)雜過程,牽涉到的分子遺傳學(xué)的改變主要包括腫瘤抑癌基因失活,癌基因的激活,其中抑癌基因失活在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用。肝癌相關(guān)基因的深入研究,對于闡明肝

2、癌的發(fā)病機理,肝癌的早期診斷及開發(fā)出新的治療手段,進而提高肝癌患者的生存率都具有重要的意義。
　　 是亮氨酸拉鏈蛋白亞家族的一員,并且為的抑制劑。最近的研究發(fā)現(xiàn),在多種正常細(xì)胞系中可以檢測到的,但在相對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系中則檢測不出;過表達基因可明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長,但對正常細(xì)胞的生長則沒多大影響；并且將導(dǎo)入裸鼠的前列腺癌移植瘤,可明顯抑制腫瘤的生長:以上結(jié)果均提示BATF2具有抑癌基因的特點。但目前關(guān)于BATF2在肝癌中的作用并不

3、清楚。本課題對BATF2基因在肝癌中的表達進行了檢測,分析了其表達水平與臨床參數(shù)的關(guān)系,并且觀察了BATF2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞Hep-G2增殖和凋亡等的影響,并對BATF2在肝癌中失活的機制進行初步探討。
　　 目的:
　　 本研究旨在研究BATF2基因在肝癌中的表達,并且分析其表達水平與臨床參數(shù)的關(guān)系,探討過表達BATF2基因?qū)Ω伟┘?xì)胞Hep-G2增殖和凋亡等的影響,并對BATF2在肝癌中失活的機制進行初步探討。
　

4、　 方法:
　　 應(yīng)用real time RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測了BATF2在50對肝癌和癌旁組織,以及5種肝癌細(xì)胞系中的表達水平；利用免疫組化技術(shù)檢測了114例肝癌石蠟包埋組織中BATF2的表達水平,分析了其與臨床參數(shù)的關(guān)系,并且探討了其與肝癌預(yù)后的關(guān)系；構(gòu)建pEGFP-M03-BATF2重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Hep-G2,利用MTS觀察BATF2過表達對腫瘤細(xì)胞增殖的影響,利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋

5、亡情況,利用transwell小室遷移實驗和平板克隆形成實驗檢測過表達BATF2對Hep-G2細(xì)胞遷移和克隆形成能力的影響；利用基因直接測序檢測BATF2基因外顯子的突變。
　　 結(jié)果:
　　 Real time RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),在所檢測的50對肝癌組織及相應(yīng)癌旁肝組織中,38例(76％)癌組織中的BATF2 mRNA水平比相應(yīng)的癌旁組織明顯降低,12例(24％)癌旁組織中的BATF2 mRNA水平低于相應(yīng)的癌組織

6、,顯示BATF2mRNA水平在癌組織中顯著降低(p=0.001)。相似地,相比于50例癌旁組織中的BATF2 mRNA平均水平,BATF2 mRNA在5種肝癌細(xì)胞系中的表達也顯著降低。進一步利用Western blot檢測BATF2的蛋白表達水平,結(jié)果45例(90％)肝癌組織中的BATF2蛋白水平低于癌旁組織,僅有5例(10％)肝癌組織中的BATF2蛋白表達水平高于癌旁組織,說明肝癌組織中BATF2的表達顯著減少(p=0.0004)。同

7、樣地,5種肝癌細(xì)胞系中BATF2的蛋白表達也均顯著降低。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),在114例肝癌組織中,有63例(55.2％)為BATF2陰性表達,分析BATF2表達與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)BATF2表達與患者年齡(p=0.006)、腫瘤大小(p=0.046)和分化程度相關(guān)(p=0.030)。生存分析顯示,BATF2低表達的患者生存時間較短(p=0.016)；多因素分析顯示,BATF2低表達是肝癌患者的一個獨立的預(yù)后因素(p=0.015)。

8、將BATF2基因過表達于肝癌細(xì)胞系Hep-G2,則細(xì)胞的增殖受到明顯抑制,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并降低細(xì)胞的遷移和克隆形成能力。對5種肝癌細(xì)胞系及8對肝癌及癌旁組織中的BATF2基因進行突變分析,并未發(fā)現(xiàn)BATF2外顯子的突變。
　　 結(jié)論:
　　 BATF2基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,作為肝癌相關(guān)的候選抑癌基因,它的低表達導(dǎo)致患者不良的預(yù)后。
　　 第二部分射頻消融聯(lián)合RetroNectin刺激的自體T淋巴細(xì)胞治

9、療原發(fā)性肝癌
　　 原發(fā)性肝癌是世界上第五大惡性腫瘤,位居腫瘤死亡因為的第三位。在我國,肝癌是第二號癌癥殺手,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。肝癌具有起病隱匿,侵襲性生長快速,惡性程度高,治療后易復(fù)發(fā),病死率高等特點,盡管治療手段發(fā)展迅速,但肝癌五年生存率仍較低。尋找有效的肝癌治療方法仍是人們努力的方向。目前,包括手術(shù)、化療、放療和生物治療的綜合治療已被廣大臨床醫(yī)師接受。
　　 射頻消融在臨床上被廣泛用于治療直徑小于5 cm的肝

10、癌,但復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高。大多數(shù)肝癌患者的免疫力低下,被認(rèn)為是肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要因為之一。射頻消融可以釋放和暴露更多的腫瘤抗原,為射頻消融和免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。RetroNectin是一種重組的人纖維蛋白片段,最近發(fā)現(xiàn)固定在培養(yǎng)介質(zhì)上的RetroNectin可以在抗CD3單抗的協(xié)同作用下使T淋巴細(xì)胞活化,增殖速度明顯加快。本課題對聯(lián)合射頻消融和RetroNectin刺激的自體T淋巴細(xì)胞治療原發(fā)性肝癌的安全性和有效性進行了探討,

11、為尋找新的肝癌治療策略提供了有益的參考。
　　 目的:
　　 評價射頻消融(RFA)聯(lián)合Retronectin刺激的自體T淋巴細(xì)胞(RAK)回輸治療原發(fā)性肝癌的安全性和療效；評價RAK細(xì)胞通過肝動脈灌注與靜脈滴注兩種方式對臨床效果的影響。
　　 方法:
　　 按照入選標(biāo)準(zhǔn)入組腫瘤直徑≤5cm的肝癌患者,共入組30名患者,分為3組:靜脈滴注組、肝動脈灌注組和對照組。所有患者的肝臟病灶均接受射頻消融術(shù)治療,靜

12、脈滴注組和肝動脈灌注組均接受RAK回輸治療,每2周1次,共6次。靜脈滴注組患者經(jīng)外周靜脈回輸RAK細(xì)胞,肝動脈灌注組患者經(jīng)肝動脈灌注RAK細(xì)胞至病灶局部。自RFA結(jié)束之日起進行隨訪。
　　 結(jié)果:
　　 利用RetroNectin技術(shù),每次由病人的50 ml外周血培養(yǎng)獲得1.17-2.68×1010個RAK細(xì)胞,比普通CIK培養(yǎng)效率更高,且以效應(yīng)型CD8+T細(xì)胞CD45RA+CCR7-為主。RAK細(xì)胞在體外對兩種肝癌細(xì)胞

13、Hep-G2和BEL-7402均有明顯的殺傷作用。給予RAK細(xì)胞回輸后,未發(fā)現(xiàn)病人有嚴(yán)重不良反應(yīng)。聯(lián)合治療結(jié)束后,患者外周血CD3+CD8+細(xì)胞的比例明顯增加,CD3+CD4+細(xì)胞比例和CD4+/CD8+明顯下降,肝動脈灌注組患者外周血的CD8+CD25+細(xì)胞比例也降低。聯(lián)合治療組患者外周血AFP降至正常水平的比例高于對照組。截止到目前,各組均未出現(xiàn)死亡病例,靜脈滴注組、肝動脈灌注組和對照組分別有3例,6例及4例病人治療后首次復(fù)發(fā)。