新的候選肝癌標(biāo)志物胸腺肽β4的初步驗(yàn)證及其影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 近年來，液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛用于生物標(biāo)志物的研究。我們采用這一技術(shù)從肝癌血清中發(fā)現(xiàn)一個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)峰，經(jīng)鑒定是胸腺肽β4(Thymosinβ4，Tβ4)。已有研究資料表明，Tβ4在多種腫瘤中表達(dá)增高，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。然而，該小分子多肽與肝癌關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。本課題在肝癌血清中篩查到該小分子多肽后，在較大樣本驗(yàn)證的同時(shí)，通過多種體外實(shí)驗(yàn)，研究Tβ4與肝癌的關(guān)系，鑒定

2、Tβ4促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為進(jìn)一步建立以Tβ4為靶標(biāo)的肝癌診治新策略提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 1、采用液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)肝癌血清中小分子多肽，通過TOF/TOF方法鑒定其中顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)峰。
　　 2、采用多種實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中Tβ4表達(dá)情況。
　　 (1)免疫熒光激光共聚焦方法檢測(cè)Tβ4在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)部位。
　　 (2) Real-

3、time PCR檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞系中Tβ4 mRNA表達(dá)量。
　　 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞系中Tβ4表達(dá)量。
　　 3、采用ELISA方法檢測(cè)正常人、慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清Tβ4含量。
　　 4、采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)臨床肝癌組織Tβ4表達(dá)。
　　 5、分析肝癌組織表達(dá)Tβ4與血清Tβ4含量之間、以及與臨床病理學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　 6、Tβ4誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的

4、實(shí)驗(yàn)。
　　 (1) MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　 (2)劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移。
　　 (3) Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。
　　 7、Tβ4誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的實(shí)驗(yàn)。
　　 (1) Annexin V-FITC法檢測(cè)肝癌細(xì)胞經(jīng)Tβ4處理后的凋亡情況。
　　 (2) Western blot分析肝癌細(xì)胞經(jīng)Tβ4處理后凋亡蛋白、抗凋亡蛋白表達(dá)的變化，以及細(xì)胞存活信號(hào)通路中的關(guān)鍵

5、分子ERK的磷酸化水平及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在肝癌血清中發(fā)現(xiàn)一組異常表達(dá)的蛋白質(zhì)峰，通過TOF/TOF方法鑒定其中一個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)峰為Tβ4。
　　 2、Tβ4在肝癌細(xì)胞中表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)。
　　 3、不同肝癌細(xì)胞系Tβ4表達(dá)水平存在差異。與正常肝細(xì)胞相比，7種肝癌細(xì)胞系中Tβ4表達(dá)量均不同程度地增高，尤其是高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞MHCC-

6、97H的Tβ4表達(dá)量是正常肝細(xì)胞的2倍左右。
　　 4、臨床肝癌標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果表明，肝癌組織表達(dá)Tβ4高于配對(duì)癌旁組織;肝癌組血清Tβ4含量高于正常人組、慢性肝炎組和肝硬化組(P＜0.05)，并且表達(dá)量在慢性肝炎-肝硬化-肝癌發(fā)展病程中呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。
　　 5、相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝癌組織Tβ4表達(dá)與配對(duì)肝癌血清Tβ4含量正相關(guān);肝癌組織高表達(dá)Tβ4分別與血清中AFP表達(dá)量、肝癌TNM分期和血管侵襲有關(guān)(P＜0.05)。

7、
　　 6、Tβ4可以顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。
　　 7、Tβ4通過激活細(xì)胞內(nèi)ERK發(fā)生磷酸化，提高肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡的能力。
　　 研究結(jié)論:
　　 液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)可用于篩查血清樣本中的小分子多肽;肝癌組織和血清高表達(dá)Tβ4，可作為一個(gè)候選的肝癌標(biāo)志物;其機(jī)制可能涉及增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，以及誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抵抗失巢凋亡等。有關(guān)研究結(jié)果為進(jìn)一步建立以Tβ4為靶